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在运行稳定的实验室序批式反应器（
SBR
）第
153
天的典型运行周期中，
SCRS
分析检测到活跃
PAO
的相对丰度为
74–89%
（基于细胞计数）（图
1a
），略低于
FISH
检测结果（
Tetrasphaera
>75%
、
Accumulibacter
约
25%
）。这一差异主要源于两种技术在定量方法上的不同：
FISH
基于探针标记的
PAO
生物体积进行定量，而
SCRS
则依据单细胞中
polyP
特征峰（
P–O–P
和
PO
₂⁻
键）的检测进行定量，能更准确反映实际参与除磷过程的活跃
PAO
表型丰度。此外，
SCRS
在
SBR
好氧阶段检出
3.8–6.7%
的活跃
GAO
表型细胞，明显高于
FISH
检测结果（
<1%
）。这一现象表明，传统分子生物学方法（如
16S rRNA
测序、
FISH
）受限于对已知菌群的识别能力及
DNA
提取
/PCR
过程中的偏差，而
SCRS
基于代谢特征进行分析，能够定量未知
GAOs
以及在特定条件下表现出聚糖代谢特征（
GAM
）的
PAO
亚群。该技术为深入解析
EBPR
系统中微生物的代谢多样性提供了有力支撑。
图
1.
基于
SCRS
分析的
活跃
PAO
和
GAO
表型
相对丰度
SCRS
不仅可基于表型特征识别
EBPR
微生物，还能原位定量分析
PAO/GAO
表型细胞内聚合物（
polyP
、糖原、
PHA
）的动态变化（图
2
）。实验结果表明，活性
PAO
表型展现出
polyP
在厌氧分解、好氧合成的典型代谢规律，且
polyP
变化量与
PO
₄
³
⁻
-P
检测结果高度一致（
R²=0.943
）（图
3
），验证了
SCRS
方法在
polyP
定量方面的准确性。值得注意的是，
SCRS
检测到厌氧初期
polyP
积累的现象，推测可能与
Tetrasphaera
通过易降解碳源发酵驱动短期磷吸收过程有关。这一发现进一步揭示了
EBPR
系统中单细胞尺度上的代谢异质性特征。
图
2.
基于
SCRS
分析的活跃
PAO
和
GAO
表型胞内聚合物平均含量
图
3.
基于
SCRS
分析的
胞内
polyP
含量变化与磷释放
/
吸收量之间的关系
在含有
Tetrasphaera
（生物量占比
>75%
）和
Accumulibacter
（约
25%
）的混合培养体系中，
SCRS
鉴定的
PAOs
在以
Cas aa
或
HAc
为碳源的磷释放
/
吸收批次实验中表现出不同的表型特征。好氧阶段结束时，
Cas aa
和
HAc
条件下活跃
PAOs
的相对丰度分别为
60.4%
和
45.7%
（表
1
），这一差异可能归因于
Tetrasphaera
分支
1
对
Cas aa
的偏好利用。值得注意的是，在以
HAc
为碳源的批次实验中检测到
3–5%
的
GAO
表型（表现为具糖原特征峰但无
polyP
特征峰），而在以
Cas aa
为碳源的实验中基本未检测到（图
1b
）。这一现象可能与
部分
Accumulibacter
分支在不同碳源条件下的代谢迁移有关。
表
1.
基于
SCRS
与
FISH
方法的
EBPR
微生物相对丰度对比
本研究还观察到
PAO
胞内
polyP
的
PO
₂⁻
特征峰呈现碳源依赖性的分布规律（图
4
）：在以
Cas aa
为碳源的实验中，
48%
的
PAO
表型特征峰位于
~1165 cm
⁻
¹
，
45%
位于
~1149 cm
⁻
¹
（图
4a
）。在以
HAc
为碳源的实验中，
51%
的
PAO
表型特征峰位于
~1172 cm
⁻
¹
，
40%
位于
~1151 cm
⁻
¹
（图
4b
）。其中，出峰位置在
~1165 cm
⁻
¹
（
Cas aa
条件）和
~1172 cm
⁻
¹
（
HAc
条件）的
PAO
表型可能源自同一
PAO
种群基于不同碳源代谢调控引发的
polyP
结构变化，亦或分别代表偏好利用氨基酸（如
Tetrasphaera
分支
1
）和乙酸（如
Accumulibacter
）的两类
PAO
种群。此外，出峰位置在
~1150 cm
⁻
¹
的
PAO
表型（占细胞总量的
18−27%
）可能是
Tetrasphaera
分支
2
或
3
中具有广谱碳源适应能力的亚群，其胞内成分稳定，
polyP
结构特征较为一致。
图
4.
PAO
胞内
polyP
表型对不同碳源的响应特征
本研究利用
FISH-Raman
联用技术，靶向分析了
S2EBPR
