正文
第2节 抗体类治疗药物的液相色谱-质谱表征
抗体类治疗药物在生产、纯化和储存过程中可能会发生多种修饰。在本节中，我们将描述其中一些修饰以及检测和定量它们的可能方法。某些修饰通常只存在于少数抗体蛋白上，但可能仍然具有功能意义。表1.1列出了已知发生在抗体和抗体类治疗药物上的翻译后修饰的质量差异和位置。
确认一级序列及检测切割
液相色谱-质谱（LC-MS）通常用于确认抗体类治疗药物的身份。全面确认氨基酸序列的工作流程包括完整质量LC-MS分析以及对肽段消化物进行“底物”LC-MS/MS测序。通过中等至高分辨率质谱仪观察到的抗体质量应与预测氨基酸序列（加上已知的翻译后修饰，如二硫键或糖基化）的理论平均质量在±20 ppm以内[3]。观察到的质量与计算质量之间的差异可能表明氨基酸序列错误、蛋白酶切割、二硫键形成不良或意外的翻译后修饰。
“底物”LC-MS/MS是确认氨基酸序列的首选方法，通常的做法是使用两种或三种不同的蛋白酶进行多次LC-MS/MS实验，以实现整个序列的LC-MS/MS覆盖。如果怀疑序列错误，“中间”分析通常用于缩小质量差异的位置，以便通过“底物”LC-MS/MS识别氨基酸变化。 抗体可能会发生意外切割，特别是在N-和C-末端附近、连接β-折叠的溶剂暴露的柔性环或铰链区。毛细管电泳-十二烷基硫酸钠（CE-SDS）或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可以检测广泛的切割，但LC-MS在检测仅丢失几个氨基酸的切割方面更具优势。某些情况下，只有在还原或变性条件下才能检测到蛋白的切割，因为切割后的蛋白部分通过二硫键或非共价相互作用保持在一起。靠近末端的轻微切割可能不会影响抗体活性（尽管丢失标签可能会导致纯化问题），但会增加抗体的异质性，并且可能是长期稳定性问题的征兆。C末端赖氨酸的部分丢失是一种非常常见的切割。其他常见切割包括末端甘氨酸（N-或C-末端）的丢失以及从组氨酸标签上丢失一个或多个组氨酸。切割通常由某些氨基酸侧链催化，并受pH（抗体通常在pH 5-7时最稳定）、温度、金属离子（尤其是Cu²⁺）的存在以及蛋白结构的影响。特别容易发生非酶促断裂的肽键包括Xaa-Ser（其中Xaa是任何氨基酸）、Asp-Xaa（在pH < 5时，尤其是Asp-Pro）、Asn-Xaa和Gly-Gly。二硫键的β-消除可能导致Xaa-Cys处的切割。如果β-消除产生的脱氢丙氨酸发生水解（图1.2C），则将在前半胱氨酸的N末端发生切割（β-消除的另一种最终产物是硫醚键）。在IgG1的铰链区，主要的切割位点是Asp-Lys（在pH < 5时）和Ser-Cys（由于在pH > 7时发生β-消除）。
切割也可能是由宿主细胞蛋白酶引起的酶促反应。宿主细胞蛋白酶的共纯化可能只有在稳定性压力测试期间才会显现出来。通常可以通过使用蛋白酶抑制剂来抑制酶促切割，但改进生产工艺和纯化过程中去除蛋白酶的协议更为理想。
半胱氨酸修饰
确保正确形成二硫键是表征重组抗体的重要步骤。典型的IgG在每个12个结构域中各有1个链内二硫键，2个二硫键连接轻链和重链，以及2到11个（亚型依赖）铰链二硫键连接两个重链。这些二硫键的重排、还原或修饰可能会对生物治疗药物产生负面影响。例如，抗体二硫键还原为游离硫醇已被观察到会降低抗原亲和力，增加聚集倾向，和/或降低热稳定性。一些常见的半胱氨酸残基修饰如图1.2所示。
在重组表达的抗体和从血清中提取的抗体中都观察到了游离硫醇（图1.2B）。可以通过Ellman试剂法或游离硫醇反应性荧光标记光谱法测量蛋白质的游离硫醇丰度，但这些方法可能存在灵敏度和精度较差的问题，并且无法提供有关游离硫醇的位置或分布的信息。如果用马来酰亚胺衍生物（如马来酰亚胺-PEG2-生物素）标记游离硫醇，则可以通过完整质量LC-MS轻松且灵敏地检测到游离硫醇，因为游离硫醇的存在会观察到显著的质量变化。Robotham和Kelly通过首先用d0-NEM标记游离硫醇，然后在还原后用d5-NEM标记剩余的半胱氨酸来确定抗体中游离硫醇的位置。在温和酸性条件下进行蛋白酶消化以防止标记丢失和重排，并使用LC-MS/MS根据其高d0/d5-NEM比值识别含有游离硫醇的肽段。当游离硫醇暴露于溶剂中时，它可能会发生半胱氨酸化和谷胱甘肽化，分别导致特征性的质量变化+119 Da和+305 Da（图1.2F）。
IgG1中连接轻链与重链的二硫键容易形成硫醚键（图1.2D），尤其是在暴露于高温或碱性条件下时。硫醚键的形成会使完整抗体的质量减少32 Da（硫的质量）。硫醚键是通过β-消除二硫键形成的脱氢丙氨酸和半胱氨酸发生反应，通过迈克尔加成形成共价键。由于这种键不可还原，因此在“底物”或“中间”LC-MS分析的还原条件下观察到硫醚连接的轻链-重链对。硫醚键的形成会降低Fab的灵活性，可能会影响双价结合。重链-轻链二硫键以及铰链链间二硫键也容易形成三硫键，其中在二硫键中插入一个硫原子（图1.2E）。人们认为三硫键是在发酵过程中由于二硫键与硫化氢的反应而形成的。Gu等人通过使用LysC在pH 6.5下消化未还原的蛋白质，然后进行“底物”LC-MS分析，确定了天然和重组抗体中三硫键的位置和相对丰度。三硫键连接的肽段比预测的二硫键连接肽段质量大32 Da。
尽管它们增加了生物治疗药物的异质性，但没有证据表明三硫键会影响抗体结合或活性，并且大多数三硫键在体内会迅速转化为二硫键。二硫键重排可能会发生在任何抗体类生物治疗药物中，但对于IgG2和IgG4亚型来说是一个特别值得关注的问题。IgG2可以存在三种不同的二硫键排列异构体：IgG2-A、IgG2-B和IgG2-A/B（图1.3）。这些异构体在高阶结构方面有所不同，这会影响热稳定性和结合效率。IgG4也容易发生二硫键重排，铰链半胱氨酸在链间和链内二硫键之间切换。因此，IgG4的重链和轻链可能通过非共价相互作用结合，并且在体内观察到IgG4抗体的Fab臂交换。可以通过对未还原抗体消化物进行“底物”LC-MS/MS分析来确定不同二硫键异构体的相对丰度。电子转移解离（ETD）或电子捕获解离（ECD）质谱/质谱碎裂技术可以选择性地断裂二硫键以释放连接的肽段，而碰撞诱导解离（CID）则会导致肽段主链的优先断裂。这些技术可以按顺序使用（即ETD后跟CID），以更有信心地识别二硫键连接的肽段。
N-糖基化
N-糖基化是抗体的常见翻译后修饰。几乎所有抗体都在Fc区的单一天冬酰胺残基（Asn-Ser-Thr）处发生N-糖基化，较小比例的抗体在重链或轻链上的其他天冬酰胺上发生N-糖基化（例如西妥昔单抗）。N-糖基化序列（Asn-X-Ser、Asn-X-Thr或偶尔的Asn-X-Cys，其中X是任何非脯氨酸氨基酸）是N-糖基化的先决条件，但并非保证。可以通过完整质量分析确定抗体的整体糖基化水平，“中间”分析可以区分Fc和Fab区的N-糖基化，“底物”分析可以确定每个N-糖基化位点的糖基化。标准反相液相色谱（RPLC）通常用于“底物”分析，但也可以使用亲水相互作用色谱（HILIC）和其他糖肽富集色谱来分离糖肽和非糖基化肽。也可以通过PNGaseF处理从蛋白上释放N-糖链，然后进行标记，并通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）或HILIC-荧光进行分析。
一般来说，用于蛋白表达的流行细胞系，如中国仓鼠卵巢（CHO）或人类胚胎肾293（HEK293），表达的抗体具有明确定义的N-糖链，由一组有限的糖基组成（即N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、岩藻糖（Fuc）以及小鼠细胞系中的N-乙酰神经氨酸（NeuAc），以及N-羟乙酰神经氨酸（NeuGc））。因此，通常可以通过质量加和单独推断出存在的N-糖链的数量和一般组成。质谱无法区分糖的异构体；“HexNAc”用于表示糖是GlcNAc或GalNAc，“Hex”用于表示Man、Glc或Gal。占据Fc N-糖基化位点的糖链通常是无唾液酸的、双天线型复杂糖链，而占据Fab位点的糖链则倾向于更加异质化并且有唾液酸化。通常，每个N-连接位点都被多种糖链物种占据，导致糖基化抗体具有异质化的质量轮廓。在LC-MS之前，通常使用PNGaseF去除N-糖链，或使用外糖苷酶将其修剪至共同核心，以便于表征其他抗体特征。通过完整质量或“中间”LC-MS进行糖基化分析可能会因O-糖基化或糖化存在而变得复杂，必须小心区分这些修饰与N-糖基化。
O-糖基化
在一些通常不用于生产抗体类治疗药物的免疫球蛋白类别上观察到了O-糖基化：IgA1、IgD和IgG3以及小鼠IgG2b。在所有这些情况下，O-糖基化位于铰链区，并且由黏液素型糖链组成，如GalNAcGalNeuAc2（或在小鼠IgG2b的情况下为GalNAcGalNeuGc2）。在完整的IgG1上未报告O-糖基化，IgG1是重组抗体最常用的亚类。然而，在单独表达的IgG1 Fc片段上、缺少一个或两个轻链的抗体构建物上以及包含IgG1型Fc结构域的融合蛋白上观察到了O-糖基化（未发表结果）。当IgG1（利妥昔单抗）的Fc片段单独表达时，观察到了IgG1 Fc片段的O-糖基化（GalNAcGalNeuAc2），但在通过木瓜蛋白酶从完整利妥昔单抗中生成相同片段时则没有观察到。人们认为O-糖基化的位点位于铰链区附近，因为当IgG的Fab部分缺失时，对该区域的接触大大增加。其他团队在将肽融合到Fc结构域或抗体时发现了意外的O-糖基化，在某些情况下，O-糖基化对融合构建物的活性产生了负面影响。
可以通过完整质量LC-MS分析检测到具有O-糖基化特征质量变化（例如，HexNAcHexNeuAc为+656 Da，HexNAcHexNeuAc2为+947 Da）的抗体。如果首先使用PNGaseF去除N-糖链，将更容易通过LC-MS检测到O-糖基化。由于除了O-糖基化发生在丝氨酸和苏氨酸残基上之外，没有O-糖基化的共识序列，因此识别O-糖基化位点比识别N-糖基化位点更具挑战性。“自上而下”LC-MS分析已用于识别O-糖基化位点，但目前“底物”LC-MS/MS是首选方法。使用HILIC富集可以有助于检测低丰度的O-糖肽。CID MS/MS谱通常由糖氧鎓离子（例如204 Da、366 Da、292 Da）主导，并且从完整糖肽中中性丢失糖残基，没有关于连接位点的证据。电子捕获解离（ECD）或电子转移解离（ETD）碎裂方法更适合于确定连接氨基酸，因为这些碎裂方法倾向于保留O-糖基化等微妙修饰。
糖化
N-末端或赖氨酸残基侧链的非酶促糖化是重组和内源性单克隆抗体的常见翻译后修饰。重组抗体的糖化通常发生在发酵过程中，当时表达的蛋白暴露于细胞培养基中的高浓度还原糖（如葡萄糖）。如果抗体在储存过程中暴露于还原糖，或者在高温和酸性pH下暴露于蔗糖（一种常见的配方缓冲液成分），也可能发生糖化。甚至在冻干的单克隆抗体上也观察到了糖化。糖化是不受欢迎的，因为它增加了生物治疗药物的异质性，并且可能还有其他负面影响。最近的一项研究发现，互补决定区（CDR）中的糖化干扰了抗原结合，并且关于糖化是否增加单克隆抗体聚集的证据尚不一致。还有担忧认为，当在体内暴露于高氧化条件下时，糖化的生物治疗药物可能会进一步降解为晚期糖化终产品（AGEs），并触发AGEs特异性受体的表达和不良免疫反应。AGEs还与重组抗体产品的变色有关。鉴于安全方面的担忧，糖化是一个必须监测和控制的属性。
