主要观点总结
本文主要介绍了纳米孔技术在单分子时间组学中的应用，包括其在揭示生物分子网络中的奥秘、单分子异质性与时间动态检测以及单分子药物筛选等方面的潜力。同时，文章也探讨了纳米孔技术面临的挑战和机遇，如提高事件特异性、检测限的提高以及结合单细胞技术的潜力等。
关键观点总结
关键观点1: 纳米孔技术的概述及其在单分子时间组学中的应用
纳米孔技术是一种在单分子水平上揭示分子异质性和时间动态的技术。它可以用于检测单个生物大分子的构象或化学修饰状态差异，并实时追踪分子间的相互作用。
关键观点2: 单分子异质性与时间动态的重要性
生物过程本质上是由单个分子依次进行的，具有内在的动态特征。从单分子和时间动态的角度考察生命的复杂性对于全面理解生物系统的调控机制至关重要。
关键观点3: 纳米孔技术在检测单分子异质性方面的优势
纳米孔技术具备独特优势，可以通过电流变化来识别单个分子，实现高分辨率的单分子质量识别，并实时追踪分子间的相互作用。
关键观点4: 纳米孔技术面临的挑战和解决方案
纳米孔技术在实现单分子时间组学方面面临诸多挑战，如提高事件特异性、检测限的提高等。通过结合机器学习算法、电渗流机制以及修饰抗体或DNA适配体等方法，可以显著提高目标分子的捕获效率和特异性。
关键观点5: 纳米孔技术在临床应用和基础研究中的潜力
纳米孔技术在临床应用和基础研究中具有巨大潜力，特别是在检测复杂环境中的低丰度物质、结合单细胞技术评估生物系统的时空演化以及单分子药物筛选等方面。
正文
纳米孔技术
纳米孔技术最初用于单分子核酸测序，但如今它的应用已经扩展至蛋白质检测、化学反应监测和生物物理特性分析等多个领域。
纳米孔是一种微小的孔道，当单个分子穿过该孔道时，离子电流会发生变化。通过精确监测这种电流变化，研究人员可以无标记地逐一识别分子的
质量、构象及其化学修饰状态
。因此，纳米孔技术被视为“单分子质谱”（single-molecule mass spectrometry, MS），在单分子层面上揭示分子异质性和时间演化。
纳米孔技术的应用已经取得多项突破。例如，研究人员利用α-溶血素（α-hemolysin）纳米孔成功区分了聚乙二醇（PEG）分子中的单个乙二醇单位。通过分析单分子穿过纳米孔时的残余电流（I/I0），验证了纳米孔在单聚合物单位分辨方面的可行性。此外，通过调整盐溶液的浓度，进一步提高了质量识别的分辨率，并将可区分的PEG聚合度范围扩展至25至50单位。
纳米孔技术也在蛋白质研究中发挥了重要作用。
例如，研究人员利用化学修饰的纳米孔实现了对不同蛋白质构象的区分。通过对蛋白质在纳米孔内通过时电流变化的详细分析，可以区分其折叠状态、部分展开状态及完全展开状态。这些研究为理解蛋白质折叠及其动态过程提供了新工具，对于与蛋白质错误折叠相关的疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）的研究具有重要意义。
单分子异质性与时间动态
生物过程本质上是由单个分子依次进行的，这意味着这些过程具有内在的动态特征。
为了全面理解生命的复杂性，必须从单分子和时间动态的角度进行考察。例如，糖基化的异质性会导致蛋白质功能的多样性，而细胞外蛋白稳态的失调与神经退行性疾病密切相关。
纳米孔技术在分子水平上检测异质性和时间动态方面具备独特优势。
例如，纳米孔可以检测单个生物大分子的构象或化学修饰状态差异，如识别糖基化和磷酸化修饰，从而帮助研究人员理解这些修饰如何随时间影响分子的功能。在研究中，研究人员利用带有高浓度正电荷的气溶素（aerolysin）纳米孔，显著延长了带负电荷的单链DNA（ssDNA）在纳米孔中的停留时间，从而实现了高分辨率的单分子质量识别。
此外，
纳米孔还可以用于实时追踪分子间的相互作用
。例如，通过在纳米孔中引入特定的配体，研究人员可以研究蛋白质-配体相互作用的动力学。
利用纳米孔的高时间分辨率，能够精确测量每次结合与解离事件的时间，从而提供关于结合亲和力和结合速率的详细信息
。这对于药物开发具有重要意义，因为它可以直接测量候选药物与目标蛋白之间的结合动力学参数，从而优化药物的选择和设计。
纳米孔系统用于单分子质量识别的原理和应用
（Credit:
Nature Methods
）
图中展示了纳米孔如何通过电流变化来识别单个分子。当分子穿过纳米孔时，离子电流会被部分阻断，产生瞬时的电流减少（称为“电流事件”）。这些电流事件的阻断程度和持续时间与分子的质量成比例。因此，通过分析这些电流事件，可以对分子进行质量识别。
通过α-溶血素（α-hemolysin）纳米孔对不同聚乙二醇（PEG）分子的单个乙二醇单位进行区分。利用电流事件的残余电平（I/I0），可以精确地识别聚乙二醇的聚合度（从25到50个单位）。这些结果与传统的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的测量结果几乎完美匹配，验证了纳米孔技术在单分子层面上对聚合物进行单聚合单位分辨的可行性。
通过提高溶液中的盐浓度来增强纳米孔的分辨率，并扩展了质量识别的范围。通过对电信号进行恢复，纳米孔可以对短暂的电流事件进行改进，以提高对低聚合度分子的分辨率。
纳米孔时间组学的应用及其挑战
在复杂生物样本中应用纳米孔时间组学面临许多挑战和机遇。例如，
在检测复杂生物样本中的单分子异质性时，纳米孔技术需要具备极高的事件特异性
。目前，残余电流或相应的残余电平被视为识别混合样本中分子类型和状态的主要参数。然而，由于纳米孔中的离子电流受到多个因素的影响，某一残余电流可能对应多个不同的分子。
为了提高事件特异性，研究人员提出了多种策略。例如，
通过结合机器学习算法，可以从纳米孔电流事件中提取更多特征，如电流的标准差、时间频谱及电流事件的形状等
。这些附加特征有助于提高复杂生物样本中分子的识别准确性。特别是，深度学习算法在自动分析纳米孔信号方面展现出巨大潜力，能够在没有人为干预的情况下自动分类和识别不同类型的分子，从而提高检测的效率和准确性。
