Nature | 揭秘蝾螈断肢再生的“超能力”：位置记忆的分子密码被破译

生物探索 · 公众号 · 生物 · 2025-05-28 17:03

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既然如此，是谁在再生时“启动”了Shh的表达，并储存了这种后侧位置信息呢？

为了寻找这些“启动者”，研究团队对蝾螈前侧和后侧皮肤结缔组织细胞（这些细胞被Prrx1+基因标记，是位置记忆的强大载体）进行了转录组（transcriptome）测序和比较分析。结果显示，前侧和后侧细胞之间约有300个基因存在显著差异表达（DESeq2分析，P值小于0.01）。在这些差异表达基因中，一个名为Hand2的转录因子（transcription factor）脱颖而出，其在后侧细胞中的表达水平最高，统计学意义也最为显著。Hand2编码一个bHLH（基本螺旋-环-螺旋）转录因子，已知在小鼠、鸡和斑马鱼的肢体芽发育中于后侧表达并诱导Shh。这提示Hand2可能在蝾螈的后侧位置记忆中扮演关键角色。

更进一步的分析显示，除Hand2外，后侧细胞还特异性表达Hoxd13和Tbx2等转录因子，而前侧细胞则表达Alx1、Lhx2和Lhx9等基因，这些都与发育中肢体的AP轴模式一致。GO分析也发现，差异表达基因富集于“细胞外基质”（extracellular matrix）和“细胞黏附”（cell adhesion）等类别，暗示前侧和后侧肢体可能存在不同的信号微环境。

为了追踪Hand2在蝾螈肢体中的动态，研究人员构建了Hand2:EGFP敲入（knock-in）蝾螈，使其内源性Hand2基因与EGFP（增强型绿色荧光蛋白）融合表达。结果显示，Hand2:EGFP在蝾螈肢体的后侧细胞中持续表达：从肢体芽（limb bud）、未受伤肢体到再生芽（blastema）均可观察到。有趣的是，在肢体再生过程中，Hand2:EGFP的荧光强度显著增加，达到基线水平的5.9 ± 0.4倍；在Shh表达启动前（再生第7天），Hand2:EGFP的荧光强度也增加2.3 ± 0.2倍。这表明Hand2在再生启动阶段被上调。

谱系追踪进一步证实，胚胎Hand2谱系细胞贡献了蝾螈前肢的后半部分和手部的2.5个指头，与Hand2的活跃表达模式吻合。这些胚胎Hand2细胞在成年期和再生时都被保留。通过3D成像，研究人员清晰地看到，Hand2谱系细胞确实能够产生Shh表达细胞。所有这些证据都强烈指向Hand2是调控蝾螈后侧身份和Shh表达的关键因子。

Hand2与Shh：一个不解之缘的“爱情故事”

那么，Hand2与Shh之间究竟是怎样的关系？Hand2是必需的吗？它足以决定后侧身份吗？

Hand2的“必要性”

研究人员利用CRISPR-Cas9技术敲除了Hand2的翻译起始密码子（translational start codon），生成了Hand2 CRISPants蝾螈。结果令人震惊：这些CRISPants蝾螈的致死率高达52%，远高于对照组的14%。在存活的Hand2 CRISPants蝾螈中，45%的肢体出现了指头数量或向外生长缺陷（n=50/112肢体），例如有9/112个肢体在肩带以外没有形成任何新的部分，这与Shh CRISPants蝾螈的表型相似。在肢体截肢后，几乎所有Hand2 CRISPants蝾螈再生的指头都更少，包括那些原本指头数量正常的肢体。

更重要的是，Hand2 CRISPants蝾螈的ZRS>TFP+细胞数量减少，或TFP表达减弱，这表明Hand2对Shh的表达是必需的。TFP信号强度与肢体发育缺陷程度呈直接负相关（斯皮尔曼等级相关系数0.74，P值为2.40 × 10-3）。

为了功能性地验证Hand2在后侧身份中的作用，研究人员使用了辅助肢体模型（Accessory Limb Model, ALM）。在此模型中，如果将后侧皮肤移植到前侧伤口，会诱导额外肢体形成。Hand2突变的后侧皮肤未能诱导额外肢体（0/6次手术），而对照组的后侧皮肤成功诱导了额外肢体（3/6次手术）。这明确证实Hand2是后侧身份形成所必需的，至少在诱导Shh表达方面。

Hand2的“充分性”

如果Hand2是必要的，那么它是否也足以诱导Shh表达和后侧身份呢？

研究人员构建了能在肢体芽和再生芽间充质（mesenchyme）中广泛表达mCherry-Hand2融合蛋白的转基因蝾螈。结果发现，Hand2的异位表达（misexpression）足以诱导异位ZRS>TFP（Shh报告基因）表达（7/9个肢体芽中观察到），并导致多指畸形（7/16个肢体）。在两种极端情况下，Hand2异位表达甚至诱导了异位肢体（2/16个病例），这在其他物种中尚未报道，但与蝾螈在AP轴不连续处形成肢体的能力一致。

当Hand2在结缔组织细胞中均匀表达时，观察到肢体向外生长受阻，形成不完整的肢体或仅为尖刺状结构。这可能是因为Hand2的广泛表达使得整个肢体场（limb field）都“后侧化”了，消除了肢体向外生长所需的前后不连续性。相比之下，Hand2弱表达的同窝动物则呈现正常的肢体形态。这种“强”与“弱”Hand2表达之间约两倍的差异，与Hand2在Shh表达前增加2.39倍的现象相似，进一步暗示Hand2的表达水平对Shh诱导至关重要。

为了从分子层面证实Hand2诱导的后侧化，研究人员对Hand2异位表达的再生芽前侧细胞进行了RNA测序。结果显示，Hand2异位表达细胞显著上调了后侧转录因子（如Hand2、Hoxd13、Klf8），并下调了前侧转录因子（如Lhx2、Lhx9、Barx1、Zfhx4、Hoxc10）。这与后侧化的基因表达特征完全一致。

功能性验证也支持了这一点：将强Hand2异位表达的前侧皮肤移植到神经支配的前侧伤口，能够上调ZRS>TFP报告基因，并诱导额外肢体形成（8/8次移植均成功）；而弱Hand2异位表达的皮肤则没有这种效果（0/8次）。

综上所述， Hand2在蝾螈肢体再生中不仅是后侧身份的必需因子，其异位表达也足以诱导Shh表达、导致多指畸形和异位肢体，并使前侧皮肤后侧化。

记忆可以“擦除”和“重写”吗？

肢体前-后轴的位置记忆在胚胎发育后是否就不可逆转地固定下来了呢？这是再生生物学领域的一个核心问题。

为了探索细胞身份的可塑性，研究团队设计了一个巧妙的移植实验：将前侧或后侧细胞移植到未标记宿主肢体的相对侧，随后进行截肢并观察其位置记忆的变化。他们为此构建了Alx4:mCherry_Hand2:EGFP双报告基因蝾螈，其中Alx4:mCherry标记前侧细胞，Hand2:EGFP标记后侧细胞。在未受伤的肢体中，Alx4:mCherry和Hand2:EGFP分别主要表达于疏松结缔组织、关节、骨骼和骨膜周围结构。