正文
碱性化合物
pka=5
，从上图可以看出，在
Ⅰ和Ⅲ阶段（在pka±1.5之外），保留时间随着pH变化不大，在Ⅱ阶段（pka±1），保留时间随着pH变化呈线性关系。黑点对应的是pka与PH值相近。从上图我们可以看出调节流动相pH可以优化色谱的选择性和分离度。当流动相的pH等于化合物的pKa时，可以最大效应的调节分离度。但是同样在上图中，在Ⅱ阶段（pka±1）阶段，由于保留时间随着pH变化呈线性关系，每当改变0.1个单位的pH可以使保留时间发生10%的变化，而在实际实验过程中流行相的pH会有微小的变化，如此会使分离的重现性较差，方法的耐受性较差。因此避免pH对保留行为的影响，所选流动相pH必须与样品的所有成分的pKa均不相等，且只有要求有±1.5个pH单位的差异（Ⅰ和Ⅲ阶段）。由于大部分化合物的pKa大于4，所以在开始建立方法时可以采用pH较低的流动相（2≤pH≤3），可以降低pH微小变化的影响。
下图表示5个化合物随着pH变化保留行为的影响。
从上图我们可以看出：调节
pH可以该此混合物中酸、碱和中性分子的保留时间，从而提高分离效果。随着pH升高保留时间显著增加的是碱性物质（化合物4和5,5更加明显为强碱），随着随着pH升高保留时间缩短的是酸性物质（化合物1和2），随着随着pH升高保留时间变化不大的是中性物质或者在该范围内完全离子化的物质。对于同时带有酸性和碱性基团的两性化合物，在RPC中的保留时间和流动相pH之间的关系会更复杂。
二：缓冲液的选择：
分离酸和碱，缓冲溶液对维持流动相恒定的pH和提高保留时间的重现性都是很重要的。因为含有有机溶剂的流动相中，以pH计测定pH 精度比较低，建议先溶剂A（水溶液）中测定pH，然后再加入有机溶剂配成流动相。虽然对流动相最终的pH有些不确定的因素，但是不影响RPC的常规操作。
在RPC中，一般根据以下几种性质选择缓冲液：
1.pKa和缓冲容量
2.溶解度
3.紫外吸光率（使用紫外检测器时）
4.挥发性（使用MS和蒸发光散射检测器）
5.离子对试剂
6.稳定性和仪器的兼容性
其中，前四种最重要。
1.pKa和缓冲容量；
缓冲容量指的是缓冲液维持恒定pH的能力，取决于：缓冲液的pKa值；缓冲液的浓度；流动相的pH。当缓冲液中的溶质的两种形态浓度相等时，即缓冲液的pKa与流动相pH相等时，缓冲能力最大。缓冲液的pKa与流动相pH相差越大时，缓冲液的能力越小。因此，缓冲液的pKa与流动相pH相差不能超过±1.0个单位（当缓冲液浓度较高时，可以放松到1.5个单位）流动相的缓冲容量一般与缓冲盐浓度成正比，通常浓度范围是5-25mmol/l。样品完全溶解在流动相中可避免在RPC分离过程中发生缓冲能力不足的问题，尤其是流动相缓冲液浓度较低或注入样品量较大时，尤为重要。
下表中列举了RPC一些缓冲盐和属性：
在流动相pH≤8，使用紫外检测器时，较多使用的缓冲盐有：磷酸盐、三氟乙酸盐、乙酸盐、甲酸盐。流动相的有效缓冲容量值得是当缓冲能力不足时，增加溶质的量并不会引起pH较大的变化。
磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个
p
Ka值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽：
NaH2PO4： pKa1＝2.12， pKa2＝7.21
Na2HPO4： pKa1＝7.21， pKa2＝12.32
配酸性缓冲液： 用 NaH2PO4，pH＝1～4，
配中性缓冲液： 用混合的两种磷酸盐，pH＝6～8，
配碱性缓冲液： 用 Na2HPO4，pH＝10～12。用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。
只要流动相的pH与表7-1所示的范围相符（pH≤3.5；6.0≤pH≤8.5；或者pH≥11），磷酸盐都是不错的选择。甲酸盐和乙酸盐的pH缓冲范围是2.5-6.0，适用于210nm或者以上的检测波长，由于具有挥发性也适用于质谱检测。在低pH时才有质谱检测碱性物质，使用乙酸铵或者甲酸铵均可以提高离子强度，从而使检测高浓度样品时不会出现拖尾峰。磷酸盐、乙酸盐、甲酸盐都是在pH小于8时最常用的缓冲液。
