重楼皂苷Ⅶ对胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移与侵袭作用及机制研究

中草药杂志社 · 公众号 · 药品 · 2021-04-20 06:29

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4 位，患者的 5 年生存率仅有 9% ^[1] 。 2017 年我国新增约 8.36 万胰腺癌新发病例和 8.51 万死亡病例 ^[2] 。胰腺癌恶性程度高、侵袭转移能力强，且由于胰腺的解剖位置较深，早期临床症状隐匿不易诊断，超过 85% 患者初次诊断时癌细胞已经出现局部浸润或转移，预后效果不佳 ^[3] 。手术结合化疗是目前胰腺癌临床治疗的主要手段，但由于胰腺癌细胞的特性，传统化疗药物极易出现耐药性，因此，抗胰腺癌的新药开发迫在眉睫。中药及其活性成分具有良好的抗肿瘤作用。重楼为百合科植物云南重楼 Paris polyphylla Smith var ． yunnanensis (Franch.) Hand- Mazz. 或七叶一枝花 P. polyphylla Smith var. chinensis (Franch.)Hara 的干燥根茎，主要分布于云南、四川、陕西等地，性微寒、味苦 ^[4] 。七叶一枝花为秦巴山区特色太白七药之一，为清热解毒类中药，用于治疗痈疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤等。现代药理学研究表明，甾体皂苷为重楼中发挥主要药效作用的成分，其苷元主要为薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元 2 类，重楼皂苷 Ⅶ 为具有偏诺皂苷元的皂苷类化合物，具有良好的抗肿瘤活性 ^[5-6] 。本研究考察了重楼皂苷 Ⅶ 对人胰腺癌 PANC-1 细胞增殖、迁移及侵袭的影响，为重楼皂苷用于抗肿瘤治疗提供基础。

1 材料

1.1 细胞

PANC-1 细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2 药品与试剂

重楼皂苷 Ⅶ （质量分数 ≥ 98% ，批号 76296‑75‑8 ）购自成都普菲德生物技术有限公司； DMEM 高糖培养基、胎牛血清、青链霉素混合液购自美国 HyClone 公司；四甲基偶氮唑蓝噻唑蓝（ MTT ）、二甲基亚砜（ DMSO ）购自美国 Sigma 公司； Hoechst 33258 染料购自美国 MedChemExpress 公司； Matrigel 基质胶购自美国 BD 公司； Transwell 小室购自美国 Corning 公司； Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（批号 20180406 ）购自上海七海复泰生物科技有限公司； RIPA 细胞裂解液、 BCA 蛋白定量试剂盒购自陕西先锋生物科技有限公司；程序性死亡分子配体 -1 （ programmed death ligand 1 ， PD-L1 ）蛋白抗体（批号 00071664 ）、半胱氨酸蛋白酶 -3 （ Caspase-3 ）抗体（批号 00027610 ）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（ poly ADP-ribose polymerase ， PARP ）抗体（批号 00022011 ）、 DNA 酶抑制物（ inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease ， ICAD ）抗体（批号 00021351 ）、 B 细胞淋巴瘤 -2 （ B-cell lymphoma-2 ， Bcl-2 ）抗体（批号 00045121 ）、 Bcl-2 相关 X 蛋白（ Bcl-associated X protein ， Bax ）抗体（批号 00039510 ）、甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ， GAPDH ）抗体（批号 10004129 ）购自美国 Proteintech 公司；羊抗鼠二抗（批号 115‑035‑003 ）购自美国 Jackson ImmunoResearch Laboratories 。

1.3 仪器

3111 型 CO ₂ 培养箱、 Multiskan GO 自动全波长酶标仪、 MicroPure 超纯水机（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）； IX73 倒置荧光显微镜（日本 Nikon 公司）； CJ-2S104 超净工作台（天津泰斯特仪器有限公司）； AX224ZH 分析电子天平（美国 OHAUS 公司）； Accuri C6 流式细胞仪（美国 BD 公司）； ChemiDoc XRS ^＋化学发光成像系统（美国 Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

PANC-1 细胞用含 10% 胎牛血清、 1% 双抗的 DMEM 高糖培养基，于 37 ℃、 5% CO ₂ 培养箱中培养。

2.2 重楼皂苷 Ⅶ 母液的配制

重楼皂苷 Ⅶ 溶于 DMSO 配制成 100 mmol/L 母液，分装保存于 − 20 ℃冰箱。临用时用 DMEM 高糖培养基稀释至不同浓度。