高分辨冷冻电镜的样品制备技术与方法论

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，即使在低电子剂量和常规电镜条件下也能获得优异的对比度。图 1 展示了一张典型的负染色显微图像。

负染色方法的显著优势在于其速度 —— 制备和成像样品所需的时间与进行凝胶电泳分析相当 —— 因此特别适合用于快速评估样品制备过程中的各种参数变化，如 pH 值调整、盐浓度和缓冲条件的优化，或色谱分离的不同组分的质量比较。该技术能够清晰显示分子的溶剂排除表面和整体形貌，因此可用于 评估蛋白质样品的均一性、尺寸分布以及结合 状 况 。

高质量均一的样品会呈现 大小一致的离散颗粒 。对平移对齐（但未旋转对齐）的负染色颗粒集进行平均处理将提供蛋白质直径的准确估计值。 这一数据应与通过溶液方法（如 DLS 或 SEC-MALS ）确定的分子尺寸保持一致 。如果观察到颗粒的大小和形状不一致，这明确表明样品存在问题，应在进行冷冻电镜样品制备之前进行深入的故障排查。

值得一提的是，负染色技术也可用于确定初步的三维结构，这些结构可以作为后续冷冻电镜结构测定的起点，尽管在现代实践中，借助较新的算法生成三维重建的初始模型往往不需要这一步骤。

负染色样品制备的详细方法已在先前文献中有所描述，我们建议读者参考这些资料以获取具体操作细节。需要强调的是，即使在高分辨率冷冻电镜技术日益普及的今天， 负染色仍然是一种快速、经济且富有价值的方法 ，可用于初步评估蛋白质样品的质量和适用性。

1.3 诊断性冷冻电镜

当确认所制备的蛋白质样品达到单分散状态，且在明确定义的溶液条件下保持稳定，并在负染色中呈现均匀分布的离散颗粒后，便可进行冷冻电镜评估（图 1 ）。

初始阶段应采用诊断水平的冷冻电镜检查，重点评估样品的三个关键特性：（ 1 ）蛋白质浓度与稳定性；（ 2 ）冰层厚度及其在载网上的均匀分布；（ 3 ）冰的相态（应均匀呈现无定形态，而非结晶状态） 。这三项特性在载网上应具备足够的一致性，以产生多个适合数据收集的区域。图 1 展示了一个核糖体样品的显微图像，清晰呈现了这些特性。

冷冻电镜的标准基底结构由支撑穿孔箔片的 3 毫米金属载网构成（图 2 ）。箔片上具有规则排列的孔阵列，可采用多种材料制作，其中最为常用的是无定形碳（表 2 ）。研究表明， 当载网和箔片采用相同材料（金）时，能显著提高支撑结构的稳定性，并将成像过程中样品的移动减少一个数量级以上，从而大幅提升图像质量 （ Russo & Passmore, 2014c ）。

图 2 冷冻电镜支架。这里展示的支架包括一个 3 毫米金属 载网 （ A ）和覆盖在 载网 表面的多孔金箔（ B 和 C ）。薄膜（厚度约 2-30 埃）可以添加在多孔箔的顶部。比例尺分别为（ A ） 0.5 毫米，（ B ） 50 微米和（ C ） 5 微米。

表 2 特定应用的试样支撑几何形状

模式	载网	多孔箔	膜
负染色	400 目	无	50-100 Å 非晶碳
诊断性冷冻	300 目	1.2/1.3 μm	无 /20 Å 非晶碳
中等分辨率冷冻 (≥3.5 Å)	300 目	1.2/1.3 μm	无 /20 Å 非晶碳
高分辨率冷冻 (<3.5 Å) >400 kDa	300 目	1.2/1.3 μm	无 /20 Å 非晶碳
高分辨率冷冻 (<3.5 Å) <400 kDa	300

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