为什么测序结果总跟你有仇？

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测序前端几十个碱基（大多数30-70bp）和后续几十个碱基（ 大多数 20个bp左右）是不可用的，如果需要把引物给测出来，建议做TA克隆，用通用载体引物测（等于是两端延长了，引物处于有效序列范围）

比如下图：

测序引物一看就是选下游引物（ 黄色 ），因为上游引物离需要的片段（绿色）太近，前面几十个碱基是无效碱基，会导致绿色前端部分无效。

b、 重复结构

单碱基重复例如aaaaaaaaa等，多碱基重复atatatatatatatat等，7、8个以上重复或者些不连续小重复（其他碱基也一样）和 GC 含量高或者低的（一般指 65% 以上或 35% 以下）就不太好测了，成功率比正常序列低，甚至低很多。

比如下图：测序引物一看就是选下游引物（ 黄色 ），为什么呢，上游引物后面都各种小重复，GC含量特别低的区域（ 红色 ）是测不过去的。

3、 测序反应个数

由于一个测序反应只能测700bp左右，所以可以设置： 单向

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