抗体及相关产品的连续下游工艺的最新进展

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连续加工的关键使能技术

声波分离

在工艺开发方面的大量投资带来了更高强度、更高生产力的细胞培养。在许多情况下，这些生产力的提高也增加了生物反应器内的生物量。对于批次上游工艺，离心或一次性深层和传统过滤介质被用于减少药物产品中的细胞和细胞碎片。然而，在高细胞密度下，离心变得不够稳健，传统过滤介质可能会提前堵塞，需要增加过滤面积，这并不总能被现有设施容纳。

对于灌注工艺，细胞保留通常通过中空纤维切向流过滤实现，无论是单向还是交替流动。然而，产品通过中空纤维的传输通常会随着时间的推移而减少，产品可能会被困在生物反应器中。因此，高细胞密度的挑战促使人们探索替代的一级澄清技术，包括声波分离。50多年来，非线性声学已在多个行业中得到应用；从医学超声到水下探测，从微流体到声悬浮。这些应用受到一组经过充分表征的物理波动方程的控制。从广义上讲，声学可以精确且智能地控制，以在连续、不结垢、可扩展的过程中凝聚并去除载体流中的颗粒。该技术的独特之处使其适合作为真正连续药物制造设施的一级澄清步骤。

声波分离器的核心处理部分是一个压电换能器和声反射器，它们跨越细胞培养液流经的流道（见图4.1）。在Pall的声波分离器中，在换能器和反射器之间建立了一个三维声驻波。在一次性谐振器内，驻波建立了一个高度调谐的压力场，其中高、低压力节点可预测地排列，颗粒根据其相对于细胞培养液的密度进行凝聚。将多个颗粒凝聚成较大的团簇，使重力能够轻松地将聚集的颗粒从悬浮液中拉出，收集并去除或重新加入到工艺中（具体取决于特定的流体学和工艺步骤的需求）。

在用于批次灌注工艺的澄清过程中，含细胞的生物反应器流体通过谐振器中的压力场。通过凝聚和去除流中的颗粒，流道将细胞从单克隆抗体（mAb）负载的渗透液中引导开，使它们能够被连续泵入浓缩的废流——渗透液作为澄清的液体传递到后续的加工步骤。在灌注工艺中，需要保留（而不是丢弃）细胞，生物反应器的进料流在声场下方切向循环，允许单克隆抗体作为渗透液不受阻碍地通过声学，而细胞则返回生物反应器进行进一步培养。在这两种应用中，专有的声学算法和精心设计的流道共同以连续、温和且高效的方式将单克隆抗体从产生单克隆抗体的细胞培养液中分离出来。

多柱色谱

多柱色谱是向连续加工转变的关键使能技术。人们一直致力于强化Protein A捕获色谱步骤。这在一定程度上是因为Protein A树脂的相对成本较高，它在下游加工成本中占了相当大的比例。Protein A树脂的一个共同特点是其对单克隆抗体的容量强烈依赖于加载步骤的停留时间。Protein A膜已被证明能够解除这种依赖关系。然而，由于膜的比表面积较低，其容量比树脂落后两倍甚至更多。为了最大化容量，Protein A树脂通常在4分钟或更长的停留时间下进行加载。长停留时间导致相对较低的生产率，这通常以每升树脂每小时纯化的产品克数来表示。在典型的批次制造场景中，Protein A柱的尺寸是根据处理生物反应器的能力以及两到四个色谱周期来确定的，这导致了大型柱和大量的资本支出。

为了解决批次Protein A步骤的不足，提出了一系列连续色谱解决方案。这些解决方案大多依赖于同时加载多个柱，从而带来更高的容量和生产率。由于可以使用次级和三级柱捕获未结合的产品，因此可以更快地进行加载（停留时间更短）。这为减少商业生物工艺中所需的树脂量以及通过更快的树脂循环改善制造经济性提供了可能性。

许多公司已经为生物制药市场开发了基于同时加载多个柱的连续色谱系统。这些系统主要根据可以操作的柱的数量来区分。

例如，Chromacon Contichrom Cube有2个柱，GE PCC有3或4个柱，NovasepBio SC有6个柱，Semba Octave有8个柱，Pall BioSMB GMP有8个柱或Pall BioSMB PD有16个柱。所有这些系统都依赖于通过将主加载柱过载至产品突破点来提高效率。通过后续柱捕获突破第一柱的产品，避免了产品损失。柱过载可以被看作是将一个较大的柱分解成较小的部分，以便更积极地利用质量传递区。所有柱都经历相同的操作，产品质量通过重复的色谱周期保持一致。为了理解柱的数量和不同系统的操作的影响，将色谱周期视为两个阶段是有用的：加载和非加载阶段。后者包括色谱周期的所有非加载步骤，包括冲洗、洗脱、再生和再平衡。最简单的操作是使用三个柱，在任何时候，两个色谱柱串联加载，而第三个柱正在进行非加载步骤。

所有柱都经历周期性的色谱操作。直接接收加载的柱最终会被产品饱和。此时，对该柱的加载可以停止，该柱被分配到非加载步骤。之前接收第一柱流过液的第二个加载柱现在直接接收加载，而再生的柱被放置在主捕获柱之后，以防止产品损失。在滴度适中时，例如1 g/L，加载步骤是速率限制步骤。在1分钟的停留时间下进行加载，可以实现>40 g/L的容量。非加载步骤也可以在1分钟的停留时间内完成，通常需要20到30个柱体积（CV），以冲洗、洗脱、清洁和再生一个Protein A柱。随着滴度的增加，加载时间减少。在10 g/L时，可能只需要4分钟的加载时间，容量为40 g/L，加载停留时间为1分钟。非加载步骤无法在这个时间框架内完成，成为速率限制步骤（见图4.2）。有多种可能的解决方案可以应对这种现象，包括减慢或停止加载，这会影响生产率。另一种选择是增加更多的柱来执行工艺的非加载步骤。这在高滴度下推动生产率。

由Chromatan开发的连续逆流切向色谱技术是多柱色谱的一种值得注意的替代方法。在这种方法中，树脂在系统中循环，减少了对固定床柱的依赖。其优势在于它促进了真正的连续洗脱，与提供离散洗脱液的柱方法不同。这代表了从当前批次柱工艺的进一步转变。这种方法的一个缺点集中在树脂的稳定性和寿命上，这必须经过验证。此外，与基于柱的色谱相比，洗脱浓度似乎较为适中，影响了下游单元操作的生产率。

其他连续色谱解决方案也已被探索。这些包括环状色谱、模拟移动床（SMB）及其变体多柱逆流溶剂梯度纯化（MCSGP）。这些方法在生物处理中引起了有限的兴趣。环状色谱依赖于在两个同心圆柱的环形空间内填充分离介质。柱缓慢旋转，而进料装置和分馏收集器保持静止。目前没有可用于操作连续环状色谱的商业系统。这可能是因为均匀填充分离基质和密封旋转部件的技术挑战。SMB通过定期切换柱入口来实现，形成分离基质和液体的模拟逆流。

SMB特别适用于手性化合物的二元分离，这导致其在天然产物合成中间体中的常见应用。目前没有生物工艺使用SMB，但它可能对需要（SEC）尺寸排阻色谱的过程有用。 MCSGP是SMB的一个变体，其中部分纯化的分数被回收到加载中。这提供了高纯度和高收率的可能性，但重新加载材料可能导致低生产率，特别是当应用于SEC时。

低pH病毒灭活

低pH病毒灭活（VI）是确保产品安全的关键步骤，通常在Protein A捕获步骤之后直接进行。在当前的批次制造工艺中，VI大多手动进行：通过泵入酸和碱进行滴定，产品的pH通常通过取样和使用校准的台式pH计进行测试来验证。虽然GE、Sartorius和Pall有可用的批次系统，但该过程并不容易自动化。随着联合灌注上游工艺和连续捕获下游工艺的考虑，这使得VI单元操作成为焦点。正在探索几种不同的VI可能性。这些可以分为3类：

连续搅拌罐反应器

唯一商业可用的连续低pH病毒灭活解决方案是Pall的Cadence VI系统。Cadence VI依赖于一个两罐系统来操作半连续VI。罐的功能交替，一个罐接收来自上游工艺的新洗脱液。另一个罐用于进行低pH灭活步骤：当过程完成时，该罐被排空，然后可以接收新的洗脱液。与此同时，另一个罐中收集的洗脱液可以通过低pH步骤进行处理。这样，产品在同一个罐中被收集和处理。Cadence VI系统可以被认为是一种自动化的当前批次工艺版本，这可能为性能验证提供了一条相对简单的路径。然而，这种方法存在一些风险，这些风险被生物制药用户小组突出强调。许多风险在系统开发过程中被识别，并通过系统设计和测试得到了缓解或减少。

这些关键风险包括通过死腿（孤立的分支或一端封闭的管段）和悬挂滴液使灭活产品受到未灭活产品的污染。通过在混合器的低点引入液体、消除飞溅以及使用具有最小持液体积和循环回路的Artesyn阀门，这种风险得到了缓解。这些特点还减少了酸和碱的回混风险，消除了在保持步骤中pH漂移的机会。另一个关键风险是pH探头，它必须在较长时间内保持精确校准。在Pall，使用机械臂将pH探头在低pH和高pH缓冲液之间转移，以模拟VI进行测试。测试显示pH探头漂移很小，在48小时内为0.05个pH单位，使这些探头适用于连续VI。

循环流反应器

自动化当前批次VI工艺的挑战以及对更连续工艺的渴望促使几个小组追求循环（活塞）流反应器。在这里，所需的低pH保持时间由曲折的流道提供。为了最小化流的轴向分布以及最小化产品在活塞流装置中停留时间的分布，开发了一种交替卷绕方向的管，以引入迪安涡流并促进均匀性。尽管有一些专利活动，但目前没有商业可用的解决方案。生物制药用户论坛识别出一些技术挑战和风险。最大的挑战集中在滴定和pH测量上。Protein A的洗脱液在洗脱峰上不同位置的蛋白质电导率和pH值各不相同。这种变异性通过在滴定前汇集材料来解决，但这仍然存在确保材料足够均匀以在进入活塞流反应器之前达到灭活pH的挑战。随着pH探头存在滞后性，这种风险被放大：在恒定流动情况下，产品可能未达到灭活pH，并且未被pH探头检测到。

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