基于网络药理学探讨清肝化瘀颗粒治疗肝癌的作用机制

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1.3.2 细胞模型构建与细胞培养 将 HepG2 细胞以含 10% 胎牛血清（购自 GIBCO ，货号 10270-106 ）的 RPMI 1640 培养基（购自 GIBCO ，货号 11875093 ）置于 37 ℃、 5% CO ₂ 细胞培养箱中进行常规传代培养。

1.3.3 CCK-8 细胞活力检测 使用 Cell Counting Kit-8 （购自 Dojindo ，日本， CK04 ）进行 CCK-8 细胞活力检测。收集对数生长期细胞，按 3 × 10 ³ 个 / 孔的密度接种于 96 孔细胞培养板，待细胞贴壁后使用等量的不同浓度的苦参碱（ 1 、 5 、 10 nmol/L ）给药并继续培养 12 h ，同时设置等量的不含苦参碱培养基处理的细胞作为对照组。每组设置 3 个重复孔。中止培养后，每个培养孔加入 CCK-8 溶液 10 μL ，避免引入气泡，同时设置不加细胞，仅添加不同浓度药物及 CCK-8 溶液的培养孔作为空白组。在培养箱中孵育 4 h ，将培养板置于酶标仪上，于 450nm 处测定各孔的吸光度（ A ），并按照下述公式计算细胞的生存率。同时确定苦参碱对 HepG2 细胞的最小抑制浓度。

细胞生存率＝ ( A _苦参碱 － A _空白 )/( A _对照 － A _空白 )

1.3.4 细胞凋亡检测 使用 Annexin V ， FITC Apoptosis Detection Kit （ 购自 Donjindo ， 日本 ， AD10 ） 进行细胞凋亡检测。肝癌细胞的收集与接种按照 “ 1.3.3 ” 项下方法进行，实验分为 4 组，分别为对照组（等量的不含苦参碱的培养基处理）、苦参碱组（给药浓度采用 “ 1.3.3 ” 项下确定的苦参碱对 HepG2 细胞的最小抑制浓度）、苦参碱联合细胞凋亡抑制剂 z-VAD-FMK 组（ z-VAD-FMK 浓度为 10 μmol/L ， 苦参碱给药浓度与苦参碱组相同）、 z-VAD-FMK 组（仅添加 10 μmol/L z-VAD-FMK ） 。收集细胞后加入 10 倍体积的 Annexin V 结合溶液 ，重悬细胞使细胞终浓度为 1 × 10 ⁶ 个 /mL 。吸取 100 μL 细胞悬液加入到新的流式管中，加入 5 μL Annexin ， FITC 聚合物，随后加入 5 μLPI 溶液。室温条件下，避光，孵育 15 min ，在流式管中加入 10 倍体积的 Annexin V 结合溶液，在流式细胞仪中上机检测。

1.3.5 细胞氧化应激标志物检测 使用总谷胱甘肽（ glutathione ， GSH ）检测试剂盒（购自碧云天生物技术有限公司，批号 S0052 ）及总超氧化物歧化酶（ superoxidedismutase ， SOD ）活性检测试剂盒（购自碧云天生物技术有限公司，批号 S0101 ）进行细胞氧化应激标志物检测。肝癌细胞的收集与接种按照 “ 1.3.3 ” 项下方法进行，苦参碱组给药浓度为 1 、 5 nmol/L ，同时设置等量的不含苦参碱的培养基处理的 HepG2 细胞作为对照组。收集细胞后按照试剂盒说明书进行细胞裂解、检测体系构建及后续反应，最后分别在酶标仪 412 nm 及 450 nm 处记录 A 并计算 GSH 及 SOD 的活性变化程度。

1.3.6 ELISA 法检测血管内皮生长因子 A （ vascular endothelial growth factor A ， VEGFA ） 含量 使用 VEGFA 定量检测试剂盒 （ 购自 R&D SYSTEMS ， SVE00 ） 进行 VEGFA 检测。肝癌细胞的收集、接种及给药按照 “ 1.3.5 ” 项下方法进行。收集细胞后按照试剂盒说明书进行细胞裂解、检测体系构建及后续反应，中止反应后将反应体系置于酶标仪 450 nm 处测定 A 并计算 VEGFA 的含量。

1.3.7 Westernblotting 检测相关蛋白水平 肝癌细胞的收集、接种及给药按照 “ 1.3.3 ” 项下方法进行。各组细胞提取总蛋白后 ， 利用二喹啉甲酸 （ bicinchoninic acid ， BCA ） 蛋白浓度测定试剂盒 （ 购自 Solarbio ， PC0020 ） 对其浓度进行测定。使用浓度为 10% 的 SDS-PAGE 蛋白电泳后将目的条带转移至醋酸纤维膜上。使用一抗在 4 ℃下孵育过夜后，用 TBST 缓冲液清洗 3 次，与二抗室温下孵育 1 h 。使用化学发光法对凝胶图像进行显影及定影，并进行扫描存档。本研究中使用的第一抗体信息：抗肿瘤蛋白 p53 （ tumor proteinp53 ， TP53 ）抗体（ Abcam ， ab26 ），抗 G ₁ /S 期特异细胞周期蛋白 D1 （ G ₁ /S-specific cyclin D1 ， CCND1 ）抗体（ Abcam ， ab16663 ）；内参蛋白第一抗体信息：抗甘油醛 -3- 磷 酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase ， GAPDH ）抗体（ CST ， 5174 ）；第二抗体信息：羊抗鼠 - 辣根过氧化物酶（ HorseradishPeroxidase ， HRP ）（ CST ， 7076 ），羊抗兔 -HRP （ CST ， 7074 ）。

1.4 肝癌细胞移植瘤动物模型实验验证

1.4.1 肝癌细胞移植瘤动物模型的建立、分组与给药 雄 性 SPF 级 BALB/C 裸鼠， 6 周龄，实验开始时体质量（ 17.6 ± 2.3 ） g ，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物生产许可证号： SCXK （京） 2019-0008 。所有裸鼠分笼饲养于中日友好医院临床研究所 SPF 级动物实验平台，采用 12 h 光 / 暗周期，自由摄食饮水，实验开始前适应性饲养 1 周，取材前 12 h 禁食。肝癌细胞移植瘤动物模型的建立与分组参考朱丹丹等 ^[17] 的方法，随机分为对照组和苦参碱给药组，每组各 5 只。收集对数生长期的 HepG2 人肝癌细胞，调整浓度至 5 × 10 ⁷ 个 /mL ，使用一次性注射器将细胞 sc 至裸鼠右侧腋窝， 0.1 mL/ 只，连续 10 d ，瘤块长至约 5 mm × 5 mm × 5 mm 认为造模成功。对照组 ip 生理盐水 1 mL ， 1 次 /d ，参考朱丹丹等 ^[17] 前期的研究结果，苦参碱给药组用药剂量 为 50 mg/kg ， ip 1.0 mg/mL 苦参碱溶液 1 mL ， 1 次 /d 。 连续给药 28 d 。

1.4.2 移植瘤瘤体 HE 染色病理检查 将裸鼠瘤块剥离后置于标记编号的包埋盒中，利用乙醇逐级脱水，二甲苯透明，并于 58 ～ 60 ℃的石蜡中浸蜡，包埋， 4 ℃过夜后置于切片机上，厚度调整为 4 μm ，连续切片， 60 ℃烤片后脱蜡，使用苏木素及 0.5% 伊红染液染色，利用中性树胶封片后置于显微镜下采集图像。

1.4.3 移植瘤瘤体

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