具有线粒体靶向功能的穿心莲内酯TPP-PEG-PE脂质体的制备及其作用于胃癌模型小鼠的机制研究

中草药杂志社 · 公众号 · 药品 · 2021-04-18 07:32

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的制备精密称取大豆磷脂 200 mg ，胆固醇 20.1 mg ， TPP-PEG-PE 或 PEG-PE 17.2 mg ， AP 30 mg ，将以上材料和药物共同溶解于适量体积的混合溶剂［氯仿 - 甲醇（ 2 ∶ 1 ）］中 ^[12] ，充分溶解后，置于旋转蒸发仪中减压浓缩成膜。真空冷冻条件下干燥 5 h ，除去残留有机溶剂。加入适量的 pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液（ phosphate buffer saline ， PBS ），于 37 ℃、 200 r/min 摇床中避光水化 1 h ；水浴超声 5 min ，使脂质膜从瓶壁上完全脱落； 0.22 μm 微孔滤膜 3 ～ 5 次，即得粒径均匀分布的脂质体 AP@TPP-PEG-PE# Lips 和 AP@PEG-PE#Lips ，备用。

2.1.2 粒径分布和 Zeta 电位测定以移液枪吸取少许 AP@TPP-PEG-PE#Lips 和 AP@PEG-PE#Lips ，加入适量蒸馏水稀释，采用 Zetasizer Nano ZS 纳米粒度电势仪测定粒径、 Zeta 电位分布，结果如图 1 所示。 AP@TPP-PEG-PE#Lips 和 AP@PEG-PE#Lips 的粒径分别为（ 23.8 ± 1.7 ）、（ 20.3 ± 1.5 ） nm ；分布较为均匀， PDI 分别为 0.242 ± 0.011 、 0.237 ± 0.010 ； Zeta 电位分别为（ 30.2 ± 1.1 ）、（ 32.2 ± 0.8 ） mV 。

2.1.3 TEM 观察移液枪吸取少量 AP@TPP-PEG-PE#Lips 和 AP@PEG-PE#Lips 溶液，滴加在 200 目铜网上，低温吹干， TEM 下找出各个样品最适合观察的质量浓度，最适质量浓度下样品采用常规的磷钨酸负染 ^[13] ，最后置 TEM 下观察脂质体的微观形态。电镜结果如图 2 所示， AP@TPP-PEG-PE#Lips 和 AP@PEG-PE#Lips 均表现为规则球形结构。

特征性分析结果表明， AP@TPP-PEG-PE#Lips 和 AP@PEG-PE#Lips 基本特性差异不显著。

2.1.4 包封率及载药量测定吸取 AP@TPP-PEG- PE#Lips 溶液 500 μL ， 15 000 r/min 高速离心 5 min ， AP@TPP-PEG-PE#Lips 截留在 0.4 mL 超滤离心管内（截留相对分子质量 10 000 ， Millipore 公司）。加入数倍甲醇， 60 ℃水浴下溶解 5 min 破坏脂质体结构，促使 AP 从脂质体中解离出来，采用 HPLC 法 ^[14] ，具体方法步骤参考游利江等的 ^[7] 报道，测定脂质体包封的 AP 质量（ M _内）；超滤膜外为游离 AP ，采用同样的方法测定游离 AP 质量（ M _外），计算脂质体的包封率为（ 81.4 ± 2.2 ） % ；冷冻干燥离心管内截留的 AP@TPP-PEG-PE#Lips 溶液，称质量计为 M ，计算 AP@TPP-PEG-PE#Lips 载药量为（ 14.3 ± 1.6 ） % 。

包封率＝ M _内 /( M _外＋ M _内 )

载药量＝ M _内 / M

M _外为离心后游离 AP 质量， M _内为脂质体中 AP 质量， M 为 AP@TPP-PEG-PE#Lips 质量

2.2 AP@TPP-PEG-PE#Lips 体外实验

2.2.1 红细胞溶血性考察称取 AP 、 AP@PEG-PE# Lips 和 AP@TPP-PEG-PE#Lips 适量， 5 mL 生理盐水溶解后，再依次用生理盐水半倍稀释成 AP 质量浓度为 5.00 、 2.50 、 1.25 、 0.62 、 0.31 、 0.16 、 0.08 mg/mL 的系列溶液，移取以上配制好的 AP 和 AP@TPP- PEG-PE#Lips 系列溶液各 200 μL 至 1.5 mL 的洁净 Eppendorf （ EP ）管中，阳性对照 EP 管中只加 200 μL 蒸馏水，阴性对照 EP 管中只加 200 μL 生理盐水，红细胞溶血实验具体操作步骤参考文献报道方法 ^[15] 。采用酶标仪测定吸光度（ A ），紫外吸收波长为 540 nm 。结果如表 1 所示， AP@TPP-PEG-PE# Lips 和 AP@PEG-PE#Lips 的溶血率都非常小，基本上保持在 5% 以下，由此表明， TPP-PEG-PE#Lips 具有较好的血液相容性。

溶血率＝ ( A _样品 ― A _阴性对照 )/( A _阳性对照 ― A _阴性对照 )

2.2.2 稳定性考察将 AP@TPP-PEG-PE#Lips 放置在 4 ℃冰箱中保存 56 d ，每隔 7 d 检测该脂质体的粒径和 Zeta 电位，结果见表 2 ，结果表明， AP@ TPP-PEG-PE#Lips 的粒径和 Zeta 电位在冷藏期间基本上变化不大，聚合物分散指数（ polymerdispersity index ， PDI ）也基本保持在 0.3 以下，相对较小。该结果表明， AP@TPP-PEG-PE#Lips 在 4 ℃存储期间具有较好的稳定性。

称取 AP@TPP-PEG-PE#Lips 约 1 mg ，加入 2 mL 胎牛血清培养基（