正文
Para_01
-
同一基因内的不同突变可能会影响编码蛋白的各种结构域，从而可能导致不同的功能，如PIK3CA或EGFR的突变所示。因此，系统地绘制热点突变在蛋白质结构域上的分布图可以提供关于各种突变如何影响蛋白质功能的见解。
-
实际上，大约46%的错义突变出现在定义明确的蛋白质结构域中，并且许多这样的突变在不同的癌症类型中频繁出现。
-
例如，p53、PI3-激酶-α（PI3Kα）、nebuline（NEBL）和zf-H2C2_2结构域在十种或更多类型的癌症中频繁发生突变。
-
在激酶中，大多数癌症热点突变位于催化环和激活环中。
-
驱动突变也存在于对蛋白质功能重要的其他结构元素中，例如短线性基序（SLIMs）和内在无序区域（IDRs）。
-
-
-
将癌症热点突变映射到相关的蛋白质结构进一步揭示，突变可能出现在蛋白质内部或外部的残基上。
-
然而，超过一半的所有癌症热点突变映射到促进蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的蛋白质表面和界面上。
-
研究表明，PPI界面残基的突变数量显著高于癌症驱动基因的整体突变率。
-
对超过10,000个人类疾病相关单残基变异的溶剂可及性分析表明，33%的突变位于蛋白质表面。
-
最近使用AlphaFold和RoseTTAFold模型对553个疾病相关人类蛋白质的分析已将与疾病相关的残基数扩展到58%，这些残基是溶剂可及的。
-
这类位于表面的癌症突变的例子包括AKT1(E17)、PIK3CA(E545)、PIK3CA(H1047)和RAS(G12)。
-
-
通过这种方式，癌症中的基因组变化与编码蛋白质表面的结构改变联系在一起。
Fig. 2: Mutational effect on protein–protein interactions.
- 图片说明
◉ 热点突变可以转化为结构域内的改变残基（红点；例如，信号转导和转录激活因子3（STAT3）的SH2结构域中的E616，短线性基序（SLIMs；例如，RAF1中的14-3-3结合基序的S257L）或内在无序区域（IDRs；例如，转录因子7样2（TCF7L2）的无序区域中的R471C；顶部面板）。
◉ 这些改变（红点）可以影响结构域间的相互作用、结合基序、翻译后修饰（PTM）基序以及整体蛋白质折叠和稳定性（中间面板）。
◉ 由突变残基引起的这种结构变化可能会增强相互作用或诱导产生在野生型对应物中不存在的新蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）（新形态PPIs（neoPPIs））。
◉ 这些突变的氨基酸还可以减少或破坏现有复合物的相互作用，导致次形态PPIs（hypoPPIs；底部面板）。
◉ 增强或减少相互作用的趋势由箭头的粗细表示。
Mutational effect on PPI interfaces
突变对蛋白质相互作用界面的影响
Para_01
-
热点突变对蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的影响通常由蛋白质改变的性质决定（图2）。
-
已经观察到，大型和多段接口往往相对平坦，没有整体凹陷或占据凹陷的残基。
-
例如，在BRAC2–RAD51复合物中观察到了这样的多段PPI接口，其中八个BRCA2重复序列与RAD51结合。
-
-
同时，大约80%的PPI至少有一对互补区域：蛋白表面的一个亚口袋及其相邻残基。
-
这表明一组选定的残基在锚定PPI和稳定这些相互作用方面起着关键作用。
-
丙氨酸扫描是一种定点诱变技术，其中特定的氨基酸残基被替换为丙氨酸，已被用来揭示这种锚定残基。
-
在这些方法中，将丙氨酸突变导致的结合自由能变化与野生型蛋白的变化进行比较，揭示了单个残基或一组残基在锚定PPI中的关键作用，定义为热点。
-
此类热点残基的突变会破坏现有的PPI，并可能为新的结合伙伴创建新的锚定残基。
-
值得注意的是，PPI接口处的一小部分残基或热点决定了大部分的结合能量，因此最常见于这些热点或其附近的致癌突变可能会导致功能变化。
Para_02
-
突变效应可以由现在位于突变诱导的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）界面的具体二级结构元件决定（图2）。
-
由于大多数PPI涉及多个接触区域（接口段），这些相互作用可以在不同的蛋白质区域中进行调节和研究。
-
结构域中的突变，例如SLIMs或IDRs，可以通过影响结构域-结构域相互作用、基序相互作用、蛋白质折叠、蛋白质稳定性或参与翻译后修饰（PTMs）的基序来调节PPI。
-
PPI界面上的热点突变可能会产生新的结构特征，导致相互作用增强或减少。
Para_03
-
为了量化突变引起的自由结合能变化，已经开发了诸如FoldX87、Flex ddG88、DDMut-PPI89和MpbPPI90等计算方法。
-
例如，FoldX分析确定了在与含溴结构域蛋白4（BRD4）的接口处SPOP中的特定突变，这些突变导致了SPOP功能丧失和功能获得表型。
-
机器学习有潜力提高我们对突变对蛋白质复合物稳定性影响的理解。
-
基于随机森林的分类方法对超过25,000种蛋白质突变-相互作用组合进行了分析，结果显示不同癌症类型中突变导致的不稳定蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）数量的变化并不显著；
-
例如，在乳腺癌、结肠癌和卵巢癌中，破坏性突变相对于非破坏性突变的流行率分别为2%、4%和6%。
-
然而，准确预测突变对PPI稳定性的影响仍然是一个挑战。
-
有限的单个蛋白质及其复合物的实验热力学测量数据、相对吉布斯自由结合能（ΔΔG）的巨大内在变异以及其他因素都增加了这一挑战，
-
因此需要将突变与PPI接口处的功能改变联系起来的实验方法。
Identification of mutation-affected PPIs
Para_01
-
基因组改变被转化为突变蛋白中的改变残基，这可能直接影响蛋白质的功能（顺式）或影响与该蛋白质相互作用的其他蛋白质（反式）。
-
因此，蛋白质表面的突变残基可能会减少与结合伙伴的相互作用，导致低形态的蛋白质-蛋白质相互作用（hypoPPIs）。
-
这些残基还可能作为新表位来吸引那些通常对其野生型对应物具有低或可忽略亲和力的蛋白质的相互作用，从而导致新的分子相互作用，称为新形态的蛋白质-蛋白质相互作用（neoPPIs）。
-
识别和表征这种由突变残基引起的后果将有助于定义癌症基因组的功能维度。
-
在这里，我们概述了已经开发和适应用于以单残基分辨率监测蛋白质-蛋白质相互作用的实验和计算方法。
PPI monitoring technologies
PPI 监测技术
Para_01
-
实验方法研究蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）极大地推进了我们对细胞过程的理解，并在解析控制生物系统的复杂相互作用网络方面发挥了重要作用。
-
最近在PPI检测技术方面的进展加速了通过突变介导的差异PPIs的发现（图3）。
-
这些方法可以大致分为基于共复合亲和力的技术和基于邻近性的测定法，每种方法都为PPIs的检测和表征提供了独特的优点。
Fig. 3: Detection technologies for differential protein–protein interaction mapping.
- 图片说明
◉ 检测技术可以大致分为基于亲和力的技术（a）和基于邻近性的技术（b-g）。
◉ a，基于亲和力的技术依赖于目标蛋白（X）与其相互作用伙伴（Y）的特异性结合，这些可以通过各种方法捕获和鉴定。
◉ 亲和捕获技术利用亲和标签，如组氨酸（HIS）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和Flag，或蛋白质特异性抗体来富集目标蛋白及其相互作用伙伴。
◉ 这些通过亲和纯化捕获的蛋白质随后可以通过Western blot分析或质谱检测。
◉ b-g，基于邻近性的技术通过严格要求相互作用蛋白质的空间邻近性来实现信号检测，在这种情况下是X和Y。
◉ 基于邻近性的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）生物传感器包括荧光共振能量转移（FRET；b）、生物发光共振能量转移（BRET；c）、蛋白质片段互补测定（PCA；d）（参见术语表部分b-d）、酵母双杂交（Y2H；e）、邻近标记测定（PLs；f）和邻近连接测定（PLAs；g）。
◉ 当供体荧光团和受体荧光团在近距离（通常在10纳米以内）时，FRET测量从供体荧光团到受体荧光团的能量转移，从而能够检测分子相互作用，例如PPI，并在生物系统中测量距离。
◉ BRET利用生物发光供体酶，例如海肾荧光素酶，当其与附近的荧光受体分子在近距离时，激活后将能量转移给该分子，产生可测量的光信号，用于检测和量化体内外的相互作用。
◉ PLA通过利用附着在DNA链上的抗体检测PPI，当这些抗体与附近的蛋白质结合时，触发一个连接反应，形成环状DNA模板，然后进行滚环扩增以通过荧光信号可视化相互作用。
◉ Y2H测定是一种基于转录报告基因的测定法，可用于绘制各种生物体中的互作网络。
◉ 在传统的Y2H测定中，两个感兴趣的蛋白质分别被遗传融合到转录因子的分裂片段上，例如Gal4的DNA结合域（BD）和激活域（AD）片段。
◉ 当发生PPI时，BD和AD被带入接近位置，并激活报告基因（如LacZ）的表达，这使得能够在细胞环境中检测二元相互作用。
◉ 其他蛋白质片段系统已被用作PCA和Y2H的标签，包括各种荧光蛋白、荧光素酶、二氢叶酸还原酶（DHFR）、内含肽和其他酶。
◉ 相反，邻近标记利用随意的生物素连接酶，如APEX2、BirA或TurboID，将其与感兴趣的蛋白质（在此示为X）融合，后者对附近的相互作用蛋白质Y进行生物素化。
◉ 这些生物素化的蛋白质随后可以通过亲和纯化识别并通过质谱检测。
◉ PLA是一种在内源蛋白质水平上原位检测PPI的方法。
◉ 该测定使用两条链接独特DNA链的抗体，当它们靠近（小于40纳米）时，杂交并形成环状DNA，然后通过荧光显微镜放大和可视化，或通过DNA测序确定。
Para_02
-
基于共复合物的技术，如亲和捕获蛋白质印迹、共免疫沉淀和亲和纯化结合质谱（AP-MS），可以检测蛋白质与其相互作用伙伴形成的共复合物。
-
在这些技术中，AP-MS 通过在天然条件下分离蛋白质组来识别蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。
-
例如，AP-MS 的进步使得在乳腺癌和头颈部癌症中进行大规模的癌症相关互作组图谱绘制成为可能，这已经开始揭示突变介导的癌症中差异性 PPIs 的全貌。
-
除了 AP-MS，交联质谱（CL-MS）作为一种稳健的技术出现了，它通过识别蛋白质复合物中邻近氨基酸残基之间的共价键来提供中等分辨率的结构信息，有助于理解系统范围内的蛋白质拓扑结构和相互作用。
-
另一种互补的方法是共分级质谱（CF-MS），它通过分析通过质谱共洗脱的蛋白质组分来进行大规模的蛋白质复合物图谱绘制，从而能够在其天然细胞环境中识别 PPIs。
-
总之，这些方法为各种生物系统中的 PPIs 的结构和动态提供了宝贵的见解。
Para_03
-
-
基于接近度的生物传感器检测方法，例如蛋白质片段互补分析（PCA）、荧光共振能量转移（FRET）、生物发光共振能量转移（BRET）、邻近连接检测（PLAs）和邻近标记，通过检测相互作用蛋白之间的紧密空间接近来检测蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs），因此主要检测二元相互作用。
-
这些检测方法已经使得大规模筛选以揭示由突变导向的差异性PPIs成为可能。
-
例如，酵母双杂交（Y2H）系统是一种基于转录因子的功能报告检测方法，已被用于绘制互作网络图谱，证明疾病突变常常破坏蛋白质相互作用。
-
当二氢叶酸还原酶蛋白质片段互补分析（DHFR-PCA）与深度突变扫描（DMS）结合使用时，已经被用来研究突变对几种选定致癌PPIs或结构域的影响。
-
新兴技术，如PLA和邻近标记，已经被用于单个PPI表征或野生型PPI映射，并且它们在绘制致癌突变介导的差异性PPIs方面的应用仍有待探索。
Para_04
-
不同的检测方法各有优缺点，可以提供关于蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的互补信息。根据不同的检测方法，读出模式可以分为一个诱饵蛋白与另一个猎物蛋白（‘一对一’）二元模式或一个诱饵蛋白与多个猎物蛋白（‘一对多’）复杂模式，通量可以从试管中的常规低通量到高密度板中的高通量不等。
-
大多数基于邻近性的二元检测方法测量蛋白质之间的直接物理相互作用，因为生成阳性信号需要严格的邻近要求。基于复合物的方法允许检测在蛋白质复合物中与多个伙伴的蛋白质相互作用，而不区分它们是直接还是间接的。
-
此外，不同的检测方法可以在各种细胞环境中进行PPI检测，例如在活细胞中（即FRET、BRET和PCA）、在固定细胞中的原位（即PLA）或在细胞裂解液中（即AP–MS和邻近标记）。
-
不同的检测格式可能需要不同的蛋白质表达水平和工程化蛋白质，例如在内源水平（特别是AP–MS和PLA）或过表达带有表位标签的蛋白质（特别是FRET、BRET、PCA和邻近标记）。
Para_05
-
FRET 和 BRET 测定格式的比率性质提供了定量评估相互作用蛋白质的能力，以检测受突变影响的差异性蛋白质-蛋白质相互作用。
-
例如，基于 BRET 的定量高通量差异筛选（qHT-dS）平台能够在活细胞中对野生型和突变型蛋白质相互作用进行单个氨基酸分辨率的比较分析。
-
qHT-dS 平台包括一个内置功能，用于监测结合伙伴的蛋白质表达。
-
鉴于蛋白质-蛋白质相互作用形成的剂量依赖性，这一点尤为重要。
-
通过校准蛋白质表达的变化，qHT-dS 能够准确地定量比较由突变引起的差异性蛋白质-蛋白质相互作用，从而在研究突变驱动的蛋白质-蛋白质相互作用变化方面具有优势。
-
然而，尽管 qHT-dS 解决了早期方法的一些局限性，但在实现全面覆盖互作组方面仍然存在挑战，特别是在内源水平的复杂生物环境中。
-
因此，具有强大灵敏度、可扩展性或能够在单个残基分辨率下捕获瞬时相互作用的新兴技术有望揭示跨肿瘤类型的突变影响的差异性蛋白质-蛋白质相互作用。
Computational approaches
计算方法
Para_01
