正文
AZD7648在提高同源重组修复（HDR）效率方面的作用，以及它对基因组的影响，特别是大规模缺失的频率
（Credit:
Nature Biotechnology
）
a. 实验的工作流程示意图。K-562细胞通过电转染与Cas9–sgRNA RNP一起导入单链寡核苷酸（ssODN）HDR供体。在电转染后，编辑的细胞用1μM的AZD7648处理3天，然后通过短读长测序（Illumina）和长读长测序（ONT）进行分析。
b. 展示了通过短读长测序检测到的K-562细胞中HDR和插入缺失（indels）的频率。该结果显示，在AZD7648处理后的细胞中，HDR的频率得到了显著提升，但同时也伴随着插入缺失的发生，表明该药物对基因编辑效率的提升存在一定的副作用。
c,d. 通过长读长测序对不同细胞系（RPE-1 p53−/−细胞和造血干细胞，HSPCs）中基因组变异进行了定量分析。具体来说，这两部分量化了编辑细胞中大于一定大小的序列的总读取比例，并且定量了大于1kb的缺失事件。在RPE-1 p53−/−细胞中（c部分），以及在HSPCs中（d部分），大规模的基因组缺失（大于1kb）频率显著增加，表明AZD7648不仅提高了HDR效率，也增加了千碱基级别缺失的频率。
AZD7648的潜在风险：大规模基因组变异
尽管AZD7648提升了HDR效率，但研究发现，其在使用过程中可能引发严重的基因组不稳定性。这些基因组改动包括千碱基（kilobase, kb）级别的大规模缺失、染色体臂的丢失以及基因组重排等，这些大规模的变异往往难以通过常规的短读长测序检测到，导致编辑后基因组状态的潜在风险被低估。
为了更全面地了解AZD7648的影响，研究人员采用了长读长测序（Long-read sequencing）、数字PCR（Droplet Digital PCR, ddPCR）以及单细胞RNA测序（scRNA-seq）等技术进行检测。例如，
在RPE-1 p53−/−细胞中，使用AZD7648进行基因编辑后，千碱基级别的大规模缺失事件从未处理时的7.5%增加到14.7%，且在多种细胞背景中，缺失事件的发生率提升了2至35倍。
在
HSPCs中，长读长测序显示在某些靶基因位点，大规模缺失的发生率从10%上升到43.3%。
此外，在一些细胞系中（如K-562细胞），研究人员还发现，AZD7648的处理可能导致整条染色体臂的丢失。例如，在K-562细胞中，使用数字PCR检测表明，AZD7648处理后染色体12的臂丢失发生率达到了20%以上。这种染色体大规模丢失对于基因组的完整性和细胞的正常功能可能具有严重的负面影响，可能导致细胞功能失常甚至细胞死亡。
为什么AZD7648会引起大规模变异？
AZD7648通过抑制NHEJ促进HDR，但它并非选择性地只增强HDR而忽略其他潜在影响。AZD7648的使用会抑制DNA-PKcs这一关键修复酶的活性，而DNA-PKcs不仅仅在NHEJ中发挥作用，它还在整个DNA损伤修复网络中具有重要作用。对DNA-PKcs的抑制可能使得细胞丧失处理某些大规模断裂或结构异常的能力，进而引发大规模的基因组改动，例如染色体臂丢失或重排等。
研究人员还发现，当AZD7648与其他编辑因子联合使用时，如在抑制Polθ的情况下，虽然能够部分减少大规模缺失的发生，但对染色体臂的丢失等问题改善不大，这表明AZD7648引发的大规模基因组变异是多因素协同作用的结果。
从单基因位点到全基因组的影响
为了进一步评估AZD7648的广泛影响，研究人员对多个细胞系进行了实验。在K-562细胞中，通过荧光蛋白（eGFP）报告系统，研究人员观察到，当对eGFP位点进行基因编辑时，AZD7648处理的细胞中，荧光蛋白的表达显著减少，这提示可能发生了与染色体重排或大片段缺失相关的现象。进一步的分析显示，AZD7648的处理可能导致整个染色体臂的丢失，从而使细胞丧失了相关基因的表达。
类似地，在造血干细胞和上呼吸道类器官中，研究人员也观察到了AZD7648导致的染色体大规模缺失现象。单细胞RNA测序（Single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）结果显示，这些细胞中某些染色体区域的基因表达显著降低，进一步验证了染色体丢失的可能性。在上呼吸道类器官中，约47.8%的细胞表现出染色体臂的缺失，而在HSPCs中，这一比例为22.5%。
临床应用的谨慎考量
尽管AZD7648在提高HDR效率方面表现出显著优势，但其带来的大规模基因组不稳定性引发了广泛关注。在基因治疗等需要高精度和高安全性的应用场景中，这些潜在的大规模基因组变异可能带来无法预料的后果。因此，在将AZD7648应用于临床之前，必须对其可能带来的所有基因组层面的影响进行全面评估。
