正文
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）对富集分析结果进行可视化处理。
1.2
实验验证
1.2.1
药物及试剂
艾片（左旋龙脑）为菊科植物艾纳香
B. balsamifera
(L.) DC.
的新鲜叶经提取加工制成的结晶，产地贵州罗甸，购于贵州罗甸，
经绵阳师范学院生命科学与技术学院田徽副教授鉴定，采用气相色谱法测得其中左旋龙脑含量
91.3%
＞
85%
，符合《中国药典》规定。尼莫地平（批号
190501
，亚宝药业集团股份有限公司）；聚山梨酯
-80
、
2,3,5-
氯化三苯基四氮唑（
2,3,5-triphenyltetrazolium-chloride
，
TTC
）、多聚甲醛（批号分别为
2019070801
、
2019030101
、
2019052001
，成都市科隆化学品有限公司）；兔抗
β-
肌动蛋白（
β-actin
）抗体（批号
LS194235
，武汉
Servicebio
公司）；兔抗蛋白激酶
B
（
protein kinase B
，
Akt
）抗体、兔抗叉头转录因子
O
亚族
3a
（
forkhead box
transcription factor
of the O class
3a
，
FOXO3a
）抗体、兔抗细胞死亡调解因子（
Bcl-2 interactingmediator of cell death
，
Bim
）抗体（批号分别为
6
、
5
、
9
，美国
CellSignaling Technology
公司）；兔抗
p-Akt
（
phospho T308
）多克隆抗体、重组兔抗
p-FOXO3a
（
phospho S253
）多克隆抗体（批号分别为
GR3348566-1
、
GR113981-8
，美国
Abcam
公司）；兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶
-3
（
cysteinyl aspartate specificproteinase 3
，批号
42214
，美国
GeneTex
公司）；过氧化酶标记的山羊抗兔
IgG
抗体（美国
Jackson ImmunoResearch
公司，批号
143146
）。
1.2.2
药物的配制
及剂量设置
龙脑作为一种小分子脂溶性单萜类物质，难溶于水，课题组前期使用
5%
聚山梨酯
-80
作为助溶剂，但由于其具有一定的刺激性和溶血毒性，且过敏反应强度与剂量、浓度及给药速率呈正相关
[12]
，故在前期基础上进行了预实验，发现
1%
聚山梨酯
-80
也可溶解艾片，因此本实验采用
1%
聚山梨酯
-80
作为助溶剂。尼莫地平是一种二氢吡啶类钙通道阻滞药物，具有扩张脑血管、抗血管痉挛、促进血液循环、保护神经元等作用，是临床当中常用的脑保护剂
[13]
，故选择其作为本实验的阳性药。精确称取艾片
6.00 g
，置于研钵中充分研匀后加入
3mL 1%
聚山梨酯
-80
，充分研磨，加入纯水
297 mL
（少量多次加入），依次配制成
0.020
、
0.010
、
0.005 mg/mL
的药液，置于
4
℃
冰箱保存备
用，给药前将药液于
37
℃
预温并摇匀。精确称取尼莫地平
4
片（
20 mg/
片），置研钵内充分研匀后加入
74 mL
纯水，配制成
1.08 mg/mL
的溶液，配制好的药液置
4
℃
冰箱保存备用，给药前将药液于
37
℃
预温并摇匀。
艾片剂量参考课题组前期实验结果，按照成人（
60 kg
）艾片日用量分别设置为
0.20
、
0.10
、
0.05 g/kg
。尼莫地平给药剂量为
0.010 8 g/kg
。
1.2.3
实验动物
健康雄性
SPF
级
SD
大鼠
84
只，
7
～
8
周龄，体质量
220
～
240 g
，购于重庆恩斯维尔生物科技有限公司，合格证号为
SYXK
（湘）
2019- 0004
，实验前在成都中医药大学动物房
（
NO.TCM-09-315
）进行适应性喂养
3 d
，自由饮水及饮食，室温维持在
25
℃左右，湿度维持（
50
±
5
）
%
，
同时室内保持明暗交替周期为
12 h/12 h
。在成都中医药大学国家中医药管理局中药药理三级科研实验室（
NO.TCM-09-315
）进行本次实验。动物实验经成都中医药大学实验动物伦理委员会批准，批准号为
TCM-2016-312
。
1.2.4
动物分组及给药
将
SD
雄性大鼠
84
只适应性饲养
3 d
后，按体质量随机分为
7
组，假手术组、模型组、溶剂模型（
1%
聚山梨酯
-80
）组、阳性药（尼莫地平）组及艾片
0.20
、
0.10
、
0.05 g/kg
组，每组
12
只。
按照
10 mL/kg ig
给予艾片各剂量药液，阳性药组给予尼莫地平，假手术组和模型组给予同体积生理盐水，溶剂模型组给予同体积
1%
聚山梨酯
-80
溶液，
1
次
/d
，连续给药
3 d
。第
3
次预防性给药
30 min
后对大鼠施予
CIRI
手术，造模成功后继续治疗给药，
1
次
/d
，连续
3 d
（实验周期
6 d
）。
1.2.5
CIRI
模型大鼠的制备
造模前
12 h
大鼠禁食不禁水。第
3
次预防性给药
30 min
后，根据线栓法
[14]
制备大脑中动脉栓塞（
middle cerebral artery occlusion
，
MCAO
）局灶性脑缺血模型大鼠，小心地分离迷走神经、左侧颈总动脉（
common carotid artery
，
CCA
）、颈外动脉（
externalcarood artery
，
ECA
）、颈内动脉（
internal carotid artery
，
ICA
），微动脉夹暂时夹闭
ICA
，近心端结扎
CCA
、
ECA
。用注射器针头将
CCA
戳一小孔，将预先标记制备好的直径为
0.286 mm
的蘸蜡鱼线插入
CCA
，松开动脉夹，使鱼线经
ICA
，大脑中动脉（
middle cerebral artery
，
MCA
）到达大脑前动脉（
anterior cerebral
artery
，
ACA
）近端，深度至颈内外动脉分叉处（
20
±
2
）
mm
，稍有阻力即停止进线，固定栓线并记录此刻时间，作为大脑局灶性缺血开始的时间，缝合切口并消毒，待缺血时间达到
90 min
，将栓线向外抽出
1 cm
，剪去多余部分，碘伏消毒，回笼饲养并观察。假手术组除不插入栓线外，其余操作同其他组。
1.2.6
判断造模成功的标准
