正文
16、热穿透试验怎么做？
答：热穿透试验的目的是确定灭菌室装载中的“最冷点”，并确认该点在预定的灭菌程序中获得充分的无菌保证值，即菌种残余量≤10-6及各检测点温度与灭菌室内平均温度的差值≤2.5℃。对于可能影响灭菌效果的操作情况的变更应做相应的验证，确认操作方法。例如：当在每个灭菌盘上增加不锈钢盖后，实际产品（溶液）内部的升温时间要比不加盖时慢2分钟，因此要在灭菌程序设定时增加2分钟的时间。热电偶的放置与满载热分布试验规程一致，将标准热电偶放在灭菌溶液中心部位。
17、热穿透试验中的模拟样品是什么概念，是指实验室小批量样品吗？
答：热穿透试验中的模拟样品是指热穿透性能与真实样品一致的样品，不是实验室小批量样品。
18、微生物挑战试验的生物指示剂的种类需要根据品种选择吗？如何选择？
答：微生物挑战试验的生物指示剂的种类及选择可以参考中国药典2005年版二部附录169灭菌法。
19、灭菌前微生物污染水平的测定方法？
答：滤膜过滤法是最常用的方法。使用前应通过验证。
20.产品的微生物限度检测结果为0CFU，没有发现耐热微生物，那么验证过程中能否采用D值稍低的枯草芽孢杆菌作为生物指示剂进行验证？
答：1）、微生物限度的检测结果和选择D值稍低的枯草芽孢杆菌作为生物指示剂之间不存在因果关系。
2）、根据提问者的问题，可以认为其采用的是残存概率法的灭菌工艺。对于残存概率法的灭菌工艺可以选择生物指示剂进行残存概率测试，仅仅是因为产品或包装本身不能承受过度杀灭，从而选择比较严格的过程控制，加上产品的初始菌数量控制，或者再加上除菌过滤工艺等等，然后选择生物指示剂进行灵敏度测试，测出平均含菌量N0，再进行不少于4个梯度菌量、足够批次、数量的产品的灭菌前后微生物限度测试（若必需，对不同灭菌时间也要进行测试），寻找并得到大于下降6个对数等级的状态参数，在满足F0值在8~12之间的条件下，从而推算出D值。
21、请问灭菌前微生物污染水平和耐热性（D值）的测试方法？
答：微生物污染水平通常采用滤膜过滤法截留微生物，再将滤膜转移到固体培养基表面，培养并作微生物计数。应注意过滤的体积、截留微生物的数量，保证足够的检出率（足量的过滤量）和可计数性（截留的微生物太多就没法计数了）。
每批产品都进行的耐热性测试并非D值测试，而是所谓沸腾试验－一种定性试验。将截留了微生物的滤膜放入装有同种产品药液的试管中，进行水浴煮沸15分钟或更长时间，对该药液进行无菌检查，如阴性则通过，呈阳性，说明污染菌是耐热菌，则需要进一步测D值。99%以上的检品是非耐热菌。
D值测定相当复杂，请参考《药品生产验证指南》（蓝皮书，国家药监局编）第三篇第三章第一节，有详细介绍。
22、怎样根据D值计算接种量？
答：芽孢接种量的计算：
Ni＝10Do(lgNo+6)/Di
其中Ni为生物指示剂耐热孢子接种数量
No为预定产品中灭菌前污染微生物的限度
Do为污染微生物允许的最大D值
Di为生物指示剂耐热孢子在产品中的D值
23、对于选择残存概率法最终灭菌的产品，如果灭菌前每批检测微生物限度，而微生物限度检测时间为72小时，而实际连续生产的生产周期远远短于72小时，其检测结果仅是对灭菌后产品无菌保证水平的参考吗？
答：显然灭菌前微生物含量检查的结果远远滞后于生产过程，其目的不是用于对当批产品的中间控制。
该检查的意义主要有两项：第一，用于评价该批产品的无菌保证水平；第二，长期积累了多批灭菌前微生物含量的数据后，可以对生产系统在灭菌前的各工艺步骤的微生物污染状况作整体的评估，从而指示该生产体系是否有效地将微生物污染控制在很好的水平，是否需要进行改进等。
24、请问微生物种类、数量研究的方法？所需的设备？如果采用残存概率法，是否在生产过程中必须对微生物水平进行测定，如果引入将增加多少成本？作为大输液生产企业，采用残存概率法，是否要建立专门的微生物实验室检测灭菌前药液微生物污染水平？
答：微生物污染的程度－即数量的检查可以按照药典收载的微生物限度检查方法进行；微生物的种类即鉴别可以从以下几方面依次展开：1）通过肉眼观察菌落形态；2）镜检形态和运动性；3）一般生化试验：革兰氏染色或3％KOH试验；4）生化鉴定（即API试验）鉴别到种。
采用残存概率法时，应该检测产品灭菌前微生物污染水平，包括污染菌的煮沸试验（如100℃，15分钟）和微生物计数。
注射剂生产企业，微生物实验室是必不可少的，其基本功能应包括原辅料的微生物限度检查，产品灭菌前微生物污染量检查，产品无菌检查，细菌内毒素检查，生产环境动态检查（空气微粒、浮游菌和沉降菌计数）。有条件的实验室还可开展以下工作：微生物的鉴别试验（建议企业集团的中心实验室开展API鉴定），生物指示剂的标定（即D值测定，建议企业集团中心实验室开展该项工作）。
25.对于过度杀灭法是否需要进行灭菌工艺验证？残存概率法的产品研发工艺研究与实际生产中验证有何区别？
答：当然需要验证，欧盟CGMP附录第83条：所有的灭菌工艺都应验证。
残存概率法是灭菌工艺的设计，本身就需要验证确认。
26、过度杀灭法是否确定不需进行微生物挑战试验？
答：过度杀灭法的内涵是产品中的微生物下降12个对数，微生物挑战试验是证明微生物的残存概率不大于10-6，故过度杀灭法可以不进行微生物挑战试验。
27、最终灭菌产品是否每个申请注册的品种都要单独进行设备验证？是否可以只进行一次设备验证，其它品种可以通用？设备验证资料是否可不附在品种验证资料中，只作为存档备查？
答：最终灭菌产品不一定每个申请注册的品种都要单独进行设备验证，如果注册品种采用相同的或更低的灭菌条件，可以只进行较高温度灭菌条件下的设备验证；针对品种灭菌条件的设备验证资料也应附在品种的验证资料中。
28、非溶液剂型、半固体或粉针剂的灭菌工艺可以计算出类似于F0值的数值吗？可以计算出SAL吗？具体规定是多少？
答：非溶液剂型、半固体或粉针剂的灭菌工艺不可以计算出F0值，但可以计算出SAL，具体可参考欧盟灭菌工艺选择的决策树。
29、关于培养基灌装试验，是针对生产线验证的，还是针对申报产品进行的（每个产品都要灌装三批验证），请问：（1）生产线验证能否代替申报产品的灌装试验（同类品种）？（2）采用何种培养基，硫乙醇酸盐和改良马丁两种培养基都要吗？（3）GMP检查中不同包装规格是否都需要进行三批次的灌装试验？
