主要观点总结
本文建立了三种破伤风抗体体外检测方法，包括间接法、双抗原法和毒素结合抑制试验，并对这三种方法进行了比较。这些方法为破伤风疫苗效价检测新方法的建立奠定了基础，具有操作简便、方便快捷、重复性高等优点，降低了动物痛苦和实验人员接触毒素的生物安全风险。三种体外检测法在血样品中破伤风抗体滴度检测方面的阳性检出率差异无统计学意。
关键观点总结
关键观点1: 研究目的
建立三种破伤风抗体体外检测方法，为破伤风疫苗效价检测新方法的建立奠定基础。
关键观点2: 方法
采用间接法、双抗原法和毒素结合抑制试验三种体外测定破伤风抗体，进行线性与范围、中间精密度、准确度、检测限的初步验证。
关键观点3: 结果
三种体外检测方法均具有良好的特异性、重复性和准确性，应用于血样品中破伤风抗体滴度检测时，对阳性样本的检出率差异无统计学意。其中间接法阳性检出率最高，双抗原法和毒素结合抑制试验的阳性检出率比较接近。
关键观点4: 讨论
与体内中和试验相比，三种体外检测方法具有操作简便、方便快捷、重复性高等优点。今后将开展以此为基础的效价检测新方法及与小鼠攻毒法一致性等方面的研究，用于接种破伤风疫苗后抗体水平的评估。
正文
1.3.1 间接法
参照WHO的相关指导文件，采用TT作为包被抗原，加入适当倍数稀释的待测血清和标准抗血清，用过碘酸钠法标记后的山羊抗人HRP结合物检测其中的破伤风抗体含量，选择适宜包被浓度及酶标记抗体工作稀释倍数，建立间接ELISA。参照中国药典2020年版四部“分析方法验证指导原则”对方法进行验证和应用研究。
1.3.2 双抗原法
参照WHO的相关指导文件，用TT作为包被抗原，加入适当倍数稀释的待测血清和标准抗血清，加入HRP标记的TT作为检测抗原，建立双抗原夹心ELISA。参照“分析方法验证指导原则”对方法进行验证和应用研究。
1.3.3 毒素结合抑制（toxin binding inhibition，ToBI）试验
参照WHO的指导文件和相关文献，将稀释后的待测血清及标准抗血清与稀释至0.1 Lf/mL的TT标准品在体外孵育2 h，然后将孵育混合物转移至包被抗体5E5的酶标板中，再加入HRP标记的抗体1B2，通过体外检测未结合的TT含量来评估待测血清中抗体水平的高低。通过计算阳性对照的均值
x̅
及标准差
s
，得出
x̅
-2
s
所对应的吸光度值，根据标准曲线求出对应的浓度值，即为该方法的检测限。
1.4.1 线性与范围
将标准品稀释至已确定的线性范围内的各浓度，每个浓度水平重复测定6次。接受标准：每个浓度水平的检测差异变异系数（coefficient of variation，CV）≤20%，拟合直线的相关系数（
r
）≥0.98，决定系数（
R
2
）≥0.99。
1.4.2 精密度
按照各种方法的线性范围，将标准品分别稀释至高（0.80 mIU/mL）、中（0.50 mIU/mL）、低（0.05 mIU/mL）3种浓度水平；每种浓度水平重复测定6次进行重复性验证；由1位操作员在不同时间测定上述3种浓度水平，进行中间精密度验证。接受标准：每种浓度水平重复测定的检测CV≤15%，不同时间检测每种浓度水平之间的CV≤15%。
1.4.3 准确度
按照各种方法的线性范围，将标准品分别稀释至高、中、低3种浓度水平，每种浓度的样品平行稀释6份，检测其抗原含量。计算同一浓度样品测定结果的CV，并将实测值与理论值比较，计算回收率。接受标准：同一浓度检测结果CV≤15%，各浓度水平的检测回收率在80%~120%。
使用Minitab17、GraphPad Prism 8.0.2及Excel 2010软件进行数据统计和处理，描述性分析3种体外检测破伤风抗体方法的相关性，并采用卡方检验评价检测率的一致性。
