正文
图3清洁和污染的梯度洗脱色谱的比较。
图3显示了梯度HPLC对水质的敏感性。表示使用75％甲醇的“梯度”的药物相关物质方法， 45分钟后甲醇升高至90％。上面的基线是相同的方法表现出严重的梯度鬼峰，使得分析无用。污染物在第一个等度周期结束时开始突破，最终随着洗脱液浓度的增加而被洗掉。这种严重系统污染的原因尚未完全确认，但强烈怀疑是
由于一个被忽视和细菌感染的净水器系统造成的
。杂质的保留范围非常广，与细菌污染产生的各种物质相当。当细菌被破坏时，它们的聚合分泌物和脂多糖细胞碎片仍保留在水中，这可能包括不容易通过吸附方法去除的极性物质。如果长时间连续使用高含水溶剂，细菌的“生物膜”可能会在仪器和管道内形成。
高效液相色谱溶剂入口过滤器应定期更换或彻底清洗
，因为这些过滤器的高表面积使其成为细菌的“迷宫般的避难所”。
用纯甲醇或乙腈定期冲洗高含水溶剂管线将有助于限制微生物生长，用二氯甲烷进一步冲洗将完全去除系统中的任何脂质和油脂。
遇到的主要生物是革兰氏阴性菌(例如假单胞菌属)。)它可以在纯水中生存和生长，并在磷酸盐或醋酸盐等的存在下茁壮成长。它们在20-35℃下快速生长，只需几天就能在高效液相色谱洗脱液中检测到。低温储存会显著降低生长，但冷藏高效液相色谱洗脱液通常并不实用。贝里已经表明，即使pH 9缓冲液也不足以阻止生长。
我们自己的微生物学家建议使用至少15%甲醇的混合物来抑制细菌生长，其他人建议使用至少5%甲醇或乙腈。贝里曾提到使用0.04%(重量/体积)和0.00004%(重量/体积)之间的叠氮化钠作为水缓冲液中的抗菌剂，尽管由于储备溶液易于分解，多兰曾描述过制备0.004%(重量/体积)(0.4克在10升水洗脱液中)以便在低至210纳米的检测波长下有效使用。
有些细菌对二氧化氯、季铵化合物和0.25%乙酸有抵抗力。通常，它们可以适应恶劣的条件，因此流动相玻璃器皿应该定期用有机溶剂清洗并完全干燥，而不是例行地用洗脱液“加满”。
细菌鬼峰问题的其他例子包括在高效液相色谱泵“密封-清洗”溶液中出现细菌生长情况。50:50乙腈：水密封清洗溶液的有机含量因蒸发而降低，随后细菌生长。用新鲜混合物替换“轻微混浊”的密封清洗溶液，可以完全去除色谱中的鬼峰。此外，
绝不能使用实验室洗瓶来补充高效液相色谱洗脱液的水量。
这种水不仅会被洗瓶塑料的提取物浸透，而且微生物的繁殖旺盛。
笔者也曾经遇到水产生鬼峰的例子。在与工厂进行分析方法转移时，有关物质的基线峰出现巨大干扰，(见下两图)，经排查后发现正常的基线图谱为
娃哈哈纯净水，工厂采用车间自己生产的注射用水，取来后放置了两天，
导致出现异常。
2、水中的无机杂质
现代反相高效液相色谱柱使用超纯(B类：酸洗或C类：:合成)二氧化硅，其痕量金属离子非常低。色谱柱的性能取决于保持这种低金属离子含量。用于梯度高效液相色谱的水必须完全去离子和纯化，这不仅是为了色谱柱，也是因为离子含量会对梯度基线产生影响。图4显示了去离子水和纯净水不足如何影响梯度基线的斜率。
无保留的紫外吸收阴离子(如亚硝酸盐、硝酸盐)最有可能是吸光度变化的原因。
图4梯度基线是用Elga Maxima净化后的水和(2)单独反渗透净化的水获得的。
3、有机溶剂
正如多兰建议有机溶剂中的杂质会集中在反相高效液相色谱柱上，然后通过痕量富集和聚焦机制洗脱，这似乎不合逻辑。然而，必须记住，在梯度的早期，溶剂混合物具有相对较低的总洗脱强度，因此来自有机溶剂的杂质仍然可以以相同的方式保留和洗脱。事实上，已经表明，
一些杂质可以被80%的有机物强烈保留，并且在90-100%有机物时作为鬼峰洗脱。
认识到这一点后，我们才认为有机溶剂质量是一个重要问题。
事实上，不同供应商之间，甚至产品批次之间的质量差异可能非常大。
图5说明了我们在供应梯度级甲醇时遇到的一个问题。
特定甲醇批次的两个独立瓶给出空白梯度色谱图，显示严重污染的上痕量。然而，五个不同批次的甲醇给出了干净的空白，如较低的痕量所示；所有其他色谱条件都相同。当时，供应商自己对污染批次的质量控制测试实际上表明它是干净的，尽管测试程序是合适的，但批次污染发生在测试后的某个时间，大概是在装瓶过程中。自该事件以来，供应商实施了改进的制造和质量保证控制，以防止再次发生事故。然而，这个例子说明了梯度液相色谱对商业供应材料质量的敏感性。除非供应商意识到微量污染的问题，并且有一些有效的方法来防止不合适的产品单元到达消费者手中，否则劣质材料批次可能仍然会有。
图5受污染和清洁的甲醇批次的比较图
布里斯托尔描述了一种高效液相色谱方法，用于区分鬼峰是来自水还是二元体系的有机溶剂。
为了评估源自水性组分的杂质，必须将不同体积的100%水(或水性缓冲液)加载到柱上然后运行一个梯度，寻找鬼峰高度的增加。如果装载90%的水和10%的有机溶剂，平衡时间加倍会使两种溶剂的杂质装载加倍，没有给出有用的信息。通过首先用10%有机洗脱液平衡系统，然后用30%有机洗脱液平衡系统后获得的梯度色谱图，可以突出有机溶剂的鬼峰。源自有机溶剂的鬼峰在从30%有机物开始的梯度中将更大。鬼峰尺寸的增加不是直接成比例的，因为杂质负载在梯度的早期也在一定程度上发生(见图7)。
