Nature | 基因治疗的“新大陆”：新生儿体内基因治疗的“黄金窗口”

正文

请到「今天看啥」查看全文

因此，研究人员一直梦想着能实现“体内”（in vivo）基因治疗——直接将基因治疗载体注入患者体内，让载体自己找到并修正目标细胞，从而绕过复杂的体外操作和预处理环节。这无疑将是基因治疗领域的一场革命。然而，如何精准、高效地将载体递送到造血干细胞的“家园”——骨髓（bone marrow, BM）中，一直是困扰研究人员的重大难题。

新生儿的“黄金窗口”：一项意想不到的发现

为了实现体内造血干细胞基因治疗的愿景，研究团队的目光聚焦在了小鼠的生命早期。他们对C57BL/6小鼠的造血系统进行了时空演化分析，结果发现了一个令人惊喜的“秘密”：新生小鼠体内，循环造血干细胞（cHSPCs, circulating haematopoietic stem and progenitor cells）的数量异常丰富，且这些细胞正处于从肝脏（liver）向骨髓（bone marrow, BM）大规模迁徙的活跃状态。

具体来看，研究人员对C57BL/6小鼠出生后第0-1天（新生儿）、1周龄、2周龄和8周龄（成年）的骨髓、外周血（PB, peripheral blood）、脾脏（spleen）和肝脏中的造血细胞组成及绝对数量进行了详细分析。结果显示，在新生儿小鼠的外周血和脾脏中，造血干细胞（HSCs, haematopoietic stem cells）的比例明显高于成年小鼠。例如，新生儿小鼠外周血中造血干细胞的绝对数量约为每微升2000个，而到8周龄时则降至约每微升100个。此外，新生儿肝脏中造血干细胞的组成也与骨髓高度相似，并且在幼鼠肝脏的造血灶中观察到了活跃的细胞增殖，包括巨核细胞（megakaryocytes），这都表明肝脏在新生儿早期仍是重要的造血器官。

这些数据描绘了一幅清晰的图景： 新生儿期是一个独特的“窗口”，此时胎儿造血的残余部分仍然存在，大量造血干细胞在血液中循环，并积极地向正在发育成熟的骨髓生态位（BM niche）归巢。这为体内基因递送提供了一个前所未有的机会，慢病毒载体可能更容易接触到并转导（transduce）这些在血液中迁徙的造血干细胞。

基于这一发现，研究人员进行了一项大胆的尝试：他们向新生C57BL/6小鼠静脉注射了表达绿色荧光蛋白（GFP, green fluorescent protein）的慢病毒载体。结果令人鼓舞，这些载体能够稳定地将基因递送到约0.5%的各种血细胞谱系中，并且在脾脏和骨髓中的绿色荧光蛋白标记水平也相当。

为了确认基因转移是否真正发生在具有长期自我更新（self-renewing）能力的造血干细胞中，研究团队进行了骨髓移植实验。他们从慢病毒载体处理过的新生小鼠骨髓中收集了基因标记的细胞，并将其移植到接受过预处理的成年小鼠体内。结果显示，在5只受体小鼠中，有4只成功实现了基因修正细胞的长期植入（engraftment），并且绿色荧光蛋白标记的细胞在所有分析的血细胞谱系和造血器官中均能检测到。更重要的是，通过整合位点分析（integration site analysis），研究人员确认这些基因修正细胞确实来源于真正的造血干细胞。在接受移植的小鼠体内，数百个不同的克隆（clone）共同贡献了造血输出，没有出现单一克隆过度扩增的现象，这表明基因修正的安全性较高。此外，即使在移植一年后，新生儿期接受慢病毒载体处理的小鼠体内的绿色荧光蛋白表达仍保持稳定。

“隐形盾牌”与“动员令”：基因递送效率的优化

尽管新生儿期提供了独特的体内基因治疗窗口，但研究团队并未止步于此。他们继续探索如何进一步提升基因递送效率。

他们首先发现，即使在2周龄小鼠体内，慢病毒载体基因转移效率也显著低于新生儿期，这进一步印证了造血干细胞在新生儿血液中高循环的重要性。为了增加慢病毒载体可及的造血干细胞数量，研究人员尝试了一种在临床上用于造血干细胞动员（mobilization）的方法——使用粒细胞集落刺激因子（G-CSF, granulocyte-colony stimulating factor）和普乐沙福（plerixafor）处理2周龄小鼠。这种“动员令”的效果非常显著：处理后，循环造血干细胞的数量急剧增加，慢病毒载体的基因转移效率也随之提升，绿色荧光蛋白阳性的CD45+细胞比例平均达到8.5%，是未动员小鼠的5倍。即使在20周后，这些小鼠骨髓、胸腺（thymus）和脾脏中的绿色荧光蛋白表达和载体拷贝数（VCN, vector copy number）仍然保持较高水平。

进一步的实验表明，即使对新生小鼠进行更短的动员方案，也能实现基因转移效率的显著提升，循环CD45+细胞中绿色荧光蛋白阳性细胞比例达到11%，提高了15倍。这提示我们，造血干细胞的“可及性”是影响基因递送效率的关键因素，而动员策略能够有效延长这一“可及窗口”至幼年小鼠。

除了动员策略，研究团队还从慢病毒载体本身入手，寻求优化。他们测试了两种不同的慢病毒载体改进策略：

抗干扰素-α（IFN-α）受体阻断抗体（MAR-1）： 研究发现，IFN-α会限制慢病毒载体对造血干细胞的体内转导。在新生小鼠体内注射MAR-1抗体，使得绿色荧光蛋白阳性细胞数量增加了2.5倍。这表明阻断IFN-α信号通路能够有效缓解体内转导的限制。

巨噬细胞吞噬屏蔽慢病毒载体（CD47high-LV）： 巨噬细胞（macrophage）的吞噬作用是体内慢病毒载体递送效率的另一个障碍。CD47分子是一种“别吃我”（don’t-eat-me）信号，高表达CD47的细胞不易被巨噬细胞吞噬。研究团队开发了一种在表面高表达CD47的慢病毒载体（CD47high-LV），就像给载体穿上了一层“隐形盾牌”。在一种对人类CD47信号敏感的非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷/白介素2受体γ（NSG, non-obese diabetic/SCID/IL2Rγ）小鼠模型中，CD47high-LV在新生儿小鼠体内的绿色荧光蛋白标记水平比C57BL/6新生儿小鼠或NSG成年小鼠高出四倍。相比之下，使用不表达CD47的慢病毒载体（CD47free-LV）则导致了绿色荧光蛋白阳性细胞的显著减少。这明确证实了“隐形盾牌”策略能有效增强慢病毒载体在造血干细胞中的基因转移。

综合这些发现，研究团队得出结论：新生儿期是体内造血干细胞基因转移的最佳窗口。虽然随着年龄增长，慢病毒载体转导的许可度（permissiveness）会降低，但通过造血干细胞动员和使用CD47high-LV等工程化载体，可以在幼年和成年小鼠中显著提高转导效率。尤其值得一提的是，新生儿和2周龄小鼠对所有剂量的慢病毒载体都耐受良好，没有出现毒性反应，而NSG成年小鼠则出现了剂量限制性毒性。

从实验室到临床：在疾病模型中的惊艳表现

这项体内基因治疗策略的最终目标是应用于临床，解决人类遗传病问题。为了验证其治疗潜力，研究团队在三种不同的小鼠疾病模型中进行了测试，这些疾病涉及不同的造血谱系和/或造血系统外组织。

腺苷脱氨酶缺乏症（ADA-SCID）：免疫重建的奇迹

腺苷脱氨酶缺乏症（ADA-SCID, adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency）是一种严重的联合免疫缺陷病，由于有毒腺苷代谢物的积累，导致T细胞、B细胞和自然杀伤细胞分化及功能受损。基因修正的淋巴细胞在ADA-SCID患者体内具有选择性生存优势，且ADA酶在全身表达，修正后的肝细胞可通过解毒作用作为永久性酶替代疗法。

请到「今天看啥」查看全文