青蒿琥酯通过miR-21/PTEN通路对人大肠癌CCL229细胞恶性生物学行为抑制作用的研究

中草药杂志社 · 公众号 · 药品 · 2021-05-08 13:18

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Trizol 试剂（批号 15596-026 ）、 PrimeScript 逆转录试剂盒（批号 RR047A ）、 SYBR Green Real-Time PCR MasterMix 试剂盒（批号 RR420A ）、 Lipofectamine 2000 试剂盒（批号 11668-027 ）购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司； RAPI 蛋白裂解液（批号 P0013 ）、 BCA 试剂盒（批号 P0010S ）购自美国 Invitrogen 公司； MTT 试剂盒（批号 GM01-500T ）、 Annexin V-FITC/PI 试剂盒（批号 40302ES20 ）购自上海翊圣生物科技有限公司； Dual-Luciferase Reporter Assay Kit 试剂盒（批号 ab228530 ）购自美国 Promega 公司； Transwell 小室（批号 353090 ）购自美国 Corning 公司；紧密连接蛋白（ ZO-1 ）抗体（批号 13663 ）、上皮钙黏蛋白（ epithelial cadheri ， E-cadherin ）抗体（批号 3195 ）、神经钙黏蛋白（ neuronal cadherin ， N-cadherin ）抗体（批号 61572S ）、锌指转录因子（ Slug ）抗体（批号 9585 ）、第 10 号染色体同源缺失性磷酸酶 - 张力蛋白（ phosphataseand tensin homolog deleted on chromosome ten ， PTEN ）抗体（批号 9188 ）、自噬相关蛋白 5 （ autophagy related protein 5 ， Atg5 ）抗体（批号 9980 ）、 Atg12 抗体（批号 4180 ）、自噬效应蛋白（ Beclin 1 ）抗体（批号 3495 ）、轻链 3- Ⅰ / Ⅱ 蛋白（ light chain 3- Ⅰ / Ⅱ ， LC3- Ⅰ / Ⅱ ）兔抗人单克隆抗体（批号 4599 ）购自美国 CST 公司； β- 肌动蛋白（ β-actin ）鼠抗人单克隆抗体（批号 20536-1-AP ）、 HRP 标记的 IgG 抗体购自美国 Protein Tech Group 公司；引物由山东维真生物科技有限公司设计并合成。

1.3 仪器

超净工作台（苏州净化设备一厂）；恒温培养箱（美国 Forma Scientific 公司）；低温高速离心机（德国 Heraeus 公司）；倒置显微镜和光学显微镜（日本 Olympus 公司）；酶联免疫检测仪器（华东电子集团医疗装备有限公司）； PCR 扩增仪（美国 ABI 公司）；流式细胞仪（美国 Beckman 公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

CCL229 细胞和 HIEC 细胞用含 10% 胎牛血清、 1% 青霉素和 1% 链霉素的 DMEM 培养基，于 37 ℃ 、 5% CO ₂ 的恒温培养箱中培养。

2.2 青蒿琥酯对 CCL229 细胞存活率的影响

取处于对数生长期的 CCL229 细胞，以 2 × 10 ⁴ / 孔接种于 96 孔板中， 100 μL/ 孔，设置对照组、青蒿琥酯（ 5 、 10 、 20 、 40 μg/mL ）组和 5- 氟尿嘧啶（ 40 μg/mL ）组，待细胞贴壁后，各给药组加入 100 μL 相应药物，对照组加入不含药物的培养基，分别培养 24 、 48 、 72 h ，加入 20 μL MTT （ 5 mg/mL ）溶液， 37 ℃ 孵育 4 h ，弃去上清液，每孔加入 150 μL DMSO ，采用酶标仪检测 490 nm 处的吸光度（ A ）值，计算细胞存活率。

2.3 青蒿琥酯对 CCL229 细胞凋亡的影响

取处于对数生长期的 CCL229 细胞，以 1 × 10 ⁵ /mL 接种于 6 孔板中， 2 mL/ 孔，设置对照组、青蒿琥酯（ 20μg/mL ）组和 5- 氟尿嘧啶（ 40 μg/mL ）组，待细胞贴壁后，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养 24 h 。收集细胞， 1000 × g 离心 5 min 后弃上清， PBS 冲洗 3 次后重悬细胞，加入 1 mL 70% 预冷乙醇溶液固定细胞；加入 PBS 离心沉淀去除固定液，加入 100μL RNA 消化酶（ 100 μg/mL ）， 37 ℃ 水浴 30 min ，加入 100 μL 碘化丙啶（ PI ， 50 μg/mL ）染色液， 4 ℃避光染色 30 min 后，采用流式细胞仪进行检测。

2.4 青蒿琥酯对 CCL229 细胞侵袭能力的影响

将 Matrigel 和无血清 RPMI 1640 培养基按 1 ∶ 1 配制成细胞外基质胶， Transwell 小室中加入 30 μL 细胞外基质胶。按“ 2.3 ”项下方法处理细胞，收集细胞，以无血清 RPMI 1640 培养基重悬，在 Transwell 小室的上室中加入 200 μL 细胞悬液，下室中加入 600 μL 含 FBS 的 RPMI 1640 培养基，培养 24 h 。擦除小室滤膜内表面细胞，于 4% 多聚甲醛中固定， PBS 冲洗 3 次后使用 0.1% 结晶紫染色，于显微镜下对穿过膜的细胞进行计数。

2.5 青蒿琥酯对 CCL229 细胞克隆形成的影响

按“ 2.3 ”项下方法处理细胞，收集细胞，台盼蓝染色后对活细胞进行计数。将细胞接种于 6 孔板，加入 3 mL 含 FBS 的 RPMI 1640 培养基，隔天更换培养基，于恒温培养箱中培养 7 d 后对各组集落数目进行计数。

2.6 青蒿琥酯对 CCL229 细胞自噬特异性蛋白及上皮间质转化 （ epithelial-mesenchymaltransition ， EMT ）相关蛋白表达的影响

按“ 2.3 ”项下方法处理细胞，收集细胞，加入 RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，采用 BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白质量浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至 PVDF 膜，加入 5% 脱脂牛奶，于室温封闭 1 h ，分别加入 Beclin1 、 LC3- Ⅰ / Ⅱ 、 Atg5 、 Atg12 、 ZO-1 、 E-cadherin 、 N-cadherin 、 Slug 、 β-actin 抗体（ 1 ∶ 2000 ）， 4 ℃ 孵育过夜， TBST 洗涤 3 次后加入 HRP 标记的 IgG 抗体（ 1 ∶ 10 000 ），于室温孵育 1 h ， TBST 洗涤 3 次后使用 ECL 发光试剂盒显影，采用 Image J 软件分析条带灰度值。

2.7 CCL229 细胞和 HIEC 细胞中 miR-21 mRNA 表达

设置 CCL229 组、 HIEC 组和青蒿琥酯（ 20 μg/mL ）组， HIEC 组加入 HIEC 细胞，其余各组加入 CCL299 细胞，以 1 × 10 ⁵ /mL 接种于 6 孔板中，待细胞贴壁后，青蒿琥酯组加入药物，培养 24 h 。收集细胞，按照试剂盒说明书提取 RNA 并合成 cDNA ，进行 qRT-PCR 分析。引物序列： miR-21 上游引物 5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAG- ACTGA-3’ ，下游引物 5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’ ； U6 上游引物 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’ ，下游引物 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’ 。

2.8 过表达或抑制 miR-21 对 CCL229 细胞 miR-21 mRNA 表达的影响

设置对照组、 miR-21 过表达阴性对照组（