Nature Medicine | 基因疗法新时代：基因编辑如何改变视网膜疾病治疗格局？

正文

请到「今天看啥」查看全文

腺嘌呤碱基编辑器（ABE）：基因修复的利器

碱基编辑技术是一种革新的基因编辑方法，与传统的CRISPR-Cas9系统不同，它无需引发DNA双链断裂，而是通过精确的化学修饰将一种碱基直接转换为另一种碱基。在该研究中，研究人员利用腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editor, ABE），实现了将腺嘌呤（A）转换为鸟嘌呤（G）的单碱基修复，从而有效纠正了ABCA4基因中的致病性c.5882G>A突变。这种技术不仅避免了双链断裂可能引发的细胞毒性，也显著提升了编辑的安全性和效率。

ABE的核心组成包括一个Cas9“切口酶”（nickase）和一个优化的tRNA腺苷脱氨酶（TadA），两者通过指导RNA（gRNA）精准定位到目标突变位点。在短暂的编辑窗口内，ABE将目标腺嘌呤脱氨化，生成鸟嘌呤，与之配对的胸腺嘧啶（T）则被逐步替换为胞嘧啶（C）。该研究通过优化gRNA设计，将突变位点精准定位在编辑窗口中，同时避免潜在的脱靶效应。通过体内和体外实验，研究人员确认，ABE在目标区域的编辑效率高达87%，而脱靶效应低至检测下限，展现了其精准性和安全性。

为了解决基因编辑工具在视网膜中递送的技术瓶颈，研究人员创新性地设计了一种双腺相关病毒（AAV）载体系统。由于ABE的编码序列超过了单个AAV的包装容量，研究团队采用了分体式载体，将ABE拆分为两个部分，通过“蛋白质自组装”恢复功能。这种设计大幅提高了ABE在视网膜细胞中的递送效率，使编辑工具能够有效作用于目标细胞，并实现基因修复。

ABE在体外环境中修复Stargardt病相关基因突变的高效性和可行性 （Credit: Nature Medicine ）

患者视网膜与健康视网膜的对比（a）

图像显示了携带ABCA4基因双等位基因突变（c.5882G>A和c.66G>A）的Stargardt病患者与健康个体视网膜的差异。 在患者视网膜中，黄斑中心区域的自发荧光信号显著降低，暗示视网膜色素上皮（RPE）细胞的萎缩。 光学相干断层扫描（OCT）图像进一步展示了患者视网膜中光感受器和RPE层的明显变薄。

双AAV分体式腺嘌呤碱基编辑策略（b）

研究采用双AAV载体系统递送ABE，以修复c.5882G>A突变，同时针对c.5883A（同义突变）也产生编辑。 图中解释了编辑窗口范围内的目标腺嘌呤位置，并描述了两种tRNA腺苷脱氨酶（WtTadA和eTadA）的作用机制。

模型系统的构建和编辑效率的评估（c）

图中列举了用于评估编辑效率的模型系统，包括视网膜光感受器和RPE细胞模型。 表格详细说明了模型的基因型、目标腺嘌呤位置、递送方式以及特定的gRNA类型（如STGD-gRNA、wt-gRNA和ms-gRNA）。

不同分割位点和ABE版本的编辑效率（d和e）

d：在携带ABCA4突变的HEK293T细胞中，使用不同分割位点的ABE7.10，评估其对目标位点（A7和A8）的编辑效率。结果显示，编辑效率因分割位点的不同而异，未分割的ABE7.10表现最佳。

e：比较了多种ABE版本（包括ABE8.5）的编辑效率，并通过双AAV递送，在人类iPS细胞衍生的RPE细胞中观察到高效编辑。

ABE8.5m的多模型编辑结果（f）

请到「今天看啥」查看全文