正文
-
肠轴的稳态失衡密切相关
[12]
。
在前期研究的基础上
[13-14]
，青礞石对癫痫临床疗效可靠，本研究采用
16S rDNA
高通量测序技术对大鼠肠道菌群的多样性进行分析，研究青礞石对
PTZ
点燃癫痫大鼠肠道微生物的影响，探讨青礞石治疗癫痫疾病可能的作用机制。
1
材料
1.1
动物
清洁级雄性
SD
大鼠购于浙江省医学科学院，合格证号：
SCXK
（浙）
2019-0002
，共
40
只，体质量
180
～
220 g
。大鼠购入后适宜条件下适应性喂养
1
周，自由饮食饮水，动物饲养于屏障环境中，
12 h
昼夜交替，室温
20
～
24
℃
，相对湿度
50%
左右。
动物实验通过南京中医药大学实验动物伦理委员会的批准，批准文号为
201910A029
1.2
药材与试剂
青礞石药材由亳州矿石专营店提供（批号
20140412
），经南京中医药大学中药鉴定学教研室吴德康教授鉴定为青礞石
ChloritiLapis
，经南京大学地球科学与工程学院孔庆友教授鉴定为变质岩类黑云母片岩，样品留存于南京中医药大学中药鉴定学教研室。卡马西平片（批号
X1395
，北京诺华制药有限公司）；戊四唑（
pentylenetetrazol
，
PTZ
）（批号
1002905179
，美国
Sigma
公司）；
E.Z.N.A.
®
soil DNA
试剂盒（
Omega Bio-tek
，美国）；
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit
（
Axygen Biosciences
，美国）；聚乙二醇
400
（
PEG 400
，化学纯，上海凌峰化学试剂有限公司）。
1.3
主要仪器
ABI GeneAmp®9700
型基因扩增仪（
ABI
，美国）；
NanoDrop2000
超微量分光光度计（
Thermo Fisher Scientific
，美国）；
DYY-6C
电泳仪（北京市六一仪器厂）。
2
方法
2.1
动物模型的建立
采用
PTZ
点燃法制备癫痫大鼠模型
[13-15]
，用生理盐水将
PTZ
配成质量浓度为
0.01 g/mL
的溶液，每天固定时间
ip
给予大鼠
35 mg/kg PTZ
进行造模。持续给药
4
周后，停
1
周，再以同剂量
PTZ
进行测试，参照
Racine
分级标准
[16-17]
，包括有无惊厥、面部阵挛、节律性点头、前肢阵挛及跌倒等特征，以大鼠连续表现
5
次
II
级或
II
级以上惊厥反应为达到点燃标准。
I
级标准：面部阵挛；
II
级标准：面部阵挛并伴节律性点头；
III
级标准：面部阵挛、伴节律性点头及前肢阵挛；
IV
级标准：面部阵挛、伴节律性点头、前肢阵挛及后肢站立；
V
级标准：面部阵挛、伴节律性点头、前肢阵挛、后肢站立并跌倒。大鼠若出现
Ⅴ
级无明显间歇的癫痫持续状态发作，给予
7%
水合氯醛
1 mL
缓解发作。实验期间，观察并记录大鼠的体质量变化、精神状态、癫痫发作情况。
2.2
给药样品的制备
卡马西平片溶于生理盐水，配成质量浓度为
0.02 g/mL
的卡马西平溶液。青礞石药材去除石英等杂质，置玛瑙研钵中研磨成细粉，过药典
6
号筛，用
PEG 400
为介质配成
0.5 g/mL
青礞石混悬液，每次给药前超声混匀。
2.3
分组
、
给药与采样
实验动物共分为
5
组，给予生理盐水的大鼠（
8
只）作为对照组；造模成功的大鼠随机均分为
4
组，即模型组，卡马西平阳性对照组，青礞石高、低剂量组。对照组和模型组
ig
给予
5 mL/kg
生理盐水；卡马西平组按
5 mL/kg
剂量
ig
给药；青礞石高、低剂量组按青礞石临床用量的
20
倍、
5
倍（临床等效剂量）设计给药高、低剂量，高剂量组按
4 mL/kg
剂量
ig
给药，低剂量组按
1 mL/kg
剂量
ig
给药。每天固定时间给药
1
次，持续给药
4
周。每周称体质量
2
次，并根据体质量变化调整剂量。最后
1
次给药后次日，异氟烷吸入麻醉后处死各组大鼠取结肠内容物，置于
−80
℃
冰箱中待测。
2.4
小肠内容物
DNA
提取和高通量测序
依据
E.Z.N.A.
®
soil DNA
试剂盒说明书进行细菌总
DNA
提取，
DNA
浓度和纯度利用
