分享|生物药CMC研发进展浅谈

药物开发主要流程为：靶点确定、discovery、临床前药学研究（IND）、临床实验（临床I、II、III期）、NDA/BLA、上市，见下流程图。

但实际上，每个阶段都是需要大量的工作与时间积累，才能走向最终上市，下表是将药物开发每个阶段关键点与时间表进行了汇总。其中discovery时间可能花的时间2-5年，笔者认为此部分工作花的时间与工作量，是非常之关键，因为它决定了后续模块的成败与速度，所以很多做药物开发的工作者，宁愿在discovery阶段将工作做得扎实详细。

CMC（Chemical Manufacturing and Control）,名词是沿用化学制药领域专有名词，也适用于生物制药，主要是生产工艺、杂质研究、质量研究，稳定性研究等药学研究资料，是药品申报资料中非常重要的部分，它是discovery与临床之间非常重要的环节，也是药品上市重要组成部分。

下表是化学制药与生物制药CMC领域对比，相对于化学制药CMC开发难度，生物制药更加难，因为生物药主要是由活的细胞或生物表达蛋白类大分子，蛋白的空间结构、翻译后修饰、稳定性等比化药复杂，工艺更加难以控制，所以在生物制药领域CMC需要结合生物技术的发展，不断提升CMC水平。

3.1 细胞株开发

细胞株是单克隆抗体药物CMC非常重要的一个模块，细胞株的好坏，直接决定工艺开发的难度与药物质量好否，甚至决定后续放大生产的成败与速度。下面简单谈谈细胞株开发的几个关键点：

1）宿主细胞和Select Marker体系选择。CHO宿主细胞种类主要有：DG44、CHO K1、CHO-S、CHOK1SV（lonza公司2002年）和CHOK1SV GS-KO（Lonza公司2012年）、CHOZN CHO K1（Merk公司（原SAFC）2006年）、Horizon Discovery CHO-K1HD-BioP3（Horizon公司）等。其中Lonaza、Merk、Horizon公司的GS缺陷型宿主细胞，在克隆筛选阶段会缩短一定时间，但收费都较为昂贵；Lifetechnologies公司的CHO-S宿主细胞，在生长最高密度具有较大优势，Fed-batch培养基最高密度达到30×10 ⁶ cells/ml以上，同时细胞培增时间在17-20小时范围，对于细胞工艺开发和放大，CHO-S宿主细胞是不错的选择。由于GS体系表达量较DHFR体系高，以及在细胞培养工艺以及放大过程中无需添加Glutamine或GlutaMax，能够避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低工艺控制难度，可有效提高细胞密度和延长细胞生存时间，同时也节省Glutamine或GlutaMax试剂费用。

2）表达载体构建。CHO细胞表达载体，主要在启动子、密码子会进行优化工作，如果是设计单个载体系统，即将轻链、重链插入一个载体中，在启动子方面可能会有差异，一般重链的启动子比轻链的启动子要强。当然商业化的表达载体，目前使用较多的是Life technologies公司的Freedom pCHO1.0载体，它是单个载体系统，基本与CHO-S宿主细胞配套，一般细胞株可以做到3.0 g/L。

3）单克隆筛选技术。目前随着科技的发展，有传统的有限稀释法、流式细胞仪法、Clone Pix system筛选法、Single Cell Printer（Cytena）、Beacon单细胞光导系统筛选法。当然还有单克隆影像学拍照仪器，如：MolecularDevices公司的CSI（Cell SelectImager）仪器、Solentim公司的Cell Metric或Cell Metric CLD等。仪器越来越高效、越来越智能化。尤其一些新技术，国内引进比较晚，例如Single Cell Printer（Cytena）、Beacon单细胞光导系统筛选法两个方法，国内企业还没有正式使用，最近有两三家刚刚购买。SingleCell Printer分选细胞较流式细胞仪对细胞的损伤要小很多，由于流式细胞仪的鞘液压力较大，以及电场的影响，导致细胞分选过程受损。Beacon单细胞光导系统是集抗体研发和细胞株构建一体的仪器，最大的优点可以快速检测单个细胞表达量以及细胞株的稳定性。

4）定点整合技术。目前工业上主要是外源基因随机整合到宿主细胞基因组中，通常需要多轮克隆筛选才能产生可接受的高表达克隆，但每当构建新的表达体系时仍然要重新筛选单克隆过程。同源重组或CRISPR/Cas9介导的同源重组技术，对已知强转录活性区实现同源重组，形成可定点插入目的基因的“Landing Pad”，大多数在强转录活性区。定点插入目的基因的细胞无需进行单克隆筛选，在有无选择压力条件下均可实现目的基因的高效稳定表达。但此技术还未大规模推广，主要原因应该技术还未成熟。

1）灌注培养工艺。流加工艺（Fed-batch）和灌流工艺（Perfusion）在达到相同的生产量，培养的体积可能相差10倍左右，所以在很多制药企业，在受场地限制和生产规模限制，而且随着Perfusion工艺技术的提高，很多产品会更加选择Perfusion工艺进行生产。例如，原来产品规模需要2000L规模，如果选择Perfusion工艺，可能仅仅需要200L规模。然而，国内使用Perfusion工艺生产单抗药物的企业局指可数，药明生物、嘉和生物、复宏汉霖等企业具有Perfusion工艺平台，其他大部分企业依然使用Fed-batch工艺。但Perfusion是单抗产业化发展的一个趋势，同时国内企业具有自主开发的培养基，成本也大大降低；国产品牌培养基发展迅速，例如 建顺、